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犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus， CDV)引起的一种高度接触性传染病。CDV的宿主主要为食肉目动物，近年来其宿主范围不断扩大至大熊猫等珍稀野生动物。金丝雀痘病毒(Canarypox virus, CNPV)属于痘病毒科禽痘病毒属，是引起野外和商业鸟舍中鸟类金丝雀痘的病原体，本研究中成功分离获得一株野鸟源类金丝雀痘样病毒。目前，商业化疫苗使用的主要是CNPV高度减毒株ALVAC，ALVAC载体疫苗利用了载体病毒在哺乳动物细胞中经历一过性感染，并能高效表达病毒编码的抗原这一特性，可以安全地产生细胞、体液和保护性免疫应答。犬瘟热重组疫苗Purevax?FerretDistemper在其敏感动物雪貂的免疫中取得了良好的免疫效果，但在其他一些动物体内的效果尚不理想。本研究首先探索并建立了基于CRISPR/Cas9技术的重组金丝雀痘病毒构建平台，并利用此平台将CDVMatrix(M)基因引入Purevax?FerretDistemper的ALVAC载体基因组中，成功构建了一株能够组装出CDV病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)的重组病毒，并对此重组病毒进行了动物免疫评价，以评估其作为新型犬瘟热疫苗的潜力，以此为大熊猫免疫提供数据支持。
第一章：类金丝雀痘样病毒的分离鉴定与遗传进化分析。将2016年3月收集的吉林市松花江风景区捕获的红胁蓝尾鸲皮肤表层的痘斑和损伤皮肤，进行PCR鉴定及测序分析确认其为禽痘病毒感染；将病变组织研磨液接种鸡胚绒毛尿囊膜成功分离获得一株禽痘病毒，电镜观察该病毒具有典型的痘病毒外观形态，命名为APV/03/2016。对病毒的部分P4b和DNApolymerase基因进行分子序列比对，结果表明APV/03/2016的两段基因序列与分离株PacificshearwaterisolatedstrainSWPV-2(KX857215)、CanarypoxvirusstrainD98-11133(GQ487567)、CanarypoxvirusstrainATCCVR-111(AY318871)、AvipoxvirusMississippiisolateP89(KC018048)和AvipoxvirusWisconsinisolateP92(KC018051)的同源性最高。遗传进化分析发现该病毒株隶属于金丝雀痘病毒进化分支(clade B)中的金丝雀痘病毒进化亚分枝(subclade B1)，可初步判定该禽痘病毒为一株类金丝雀痘样病毒。这提示我们新的禽痘病毒宿主如红胁蓝尾鸲正在不断出现，为保护这些潜在的病毒宿主，应加强对禽痘病毒循环和进化的监测。此外，本章研究为后续进行的金丝雀痘病毒疫苗株改造提供了细胞和金丝雀痘病毒培养技术细节方面的参考。
第二章：基于CRISPR/Cas9技术的重组金丝雀痘病毒构建平台的建立。由于传统同源重组法构建重组病毒效率低下，本实验探索并建立一种基于CRISPR/Cas9技术的重组金丝雀痘病毒构建平台。研究中首次利用CRISPR/Cas9技术对ALVAC基因组C5ORF进行编辑，并通过同源性定向修复(Homology Directed Repair，HDR)将荧光标记基因mCherry引入ALVAC基因组，成功构建出一株表达荧光标记蛋白mCherry的重组病毒ALVAC-mCherry-CDV-F-H。CRISPR/Cas9技术的使用相比传统同源重组方法显著提升了重组效率，同时将重组病毒中含有外源DNA的目标重组病毒所占比例从传统方法的1-5%提升到了70-90%。mCherry基因的表达使重组病毒筛选过程可视化，大大缩短了纯化重组病毒的时间。通过对三条靶定C5ORF的gRNA鉴定发现，C5gRNA2编辑效率最高，达到90%，挑选其作为后续试验中引导Cas9工作的gRNA。该平台的成功建立为金丝雀痘病毒载体的利用和重组疫苗的构建提供了可靠的技术支持。
第三章：犬瘟热病毒M基因重组ALVAC的构建及鉴定。为了提升Purevax?FerretDistemper疫苗动物免疫原性，本实验基于病毒样颗粒可能的免疫增强特性对原有疫苗进行修饰。利用CRISPR/Cas9技术结合先期建立的重组金丝雀痘病毒构建平台，在ALVAC基因组C5ORF位点形成DNA双链断裂(DSB)，并通过同源性定向修复将CDV-M基因及mCherry基因插入ALVAC基因组，同时替换掉C5ORF，成功构建重组病毒ALVAC-CDV-M-F-H/C5-。通过对筛选纯化获得的ALVAC-CDV-M-F-H/C5-进行PCR、噬斑滴定、WesternBlot及电镜等鉴定，结果表明，拯救病毒的复制能力与母本病毒相当，且能够同时表达CDV-M、F和H蛋白并成功组装CDV-VLPs，组装的CDV-VLPs能够被释放到细胞培养上清中。该研究进一步验证了利用基因编辑技术平台改造病毒的可行性，同时为犬瘟热候选疫苗的研究提供了新的设计思路和物质储备。
第四章：重组病毒在不同动物体内的免疫原性评估。为了评价重组病毒对动物的免疫效果及安全性，将ALVAC-CDV-M-F-H/C5-、ALVAC-CDV-F-H分别接种了狐狸、水貂和犬，并设立了空白对照组，对诱导产生的免疫应答进行了检测和分析。免疫结果显示ALVAC-CDV-M-F-H/C5-和ALVAC-CDV-F-H均能够有效的诱导狐狸、水貂和犬产生特异性中和抗体，而前者在免疫初期的抗体阳性率更高，可诱导产生更高水平的中和抗体，与ALVAC-CDV-F-H存在统计学上的显著性差异。通过比较中和抗体滴度，确定ALVAC-CDV-M-F-H/C5-的最佳免疫程序为：肌肉注射途径免疫，免疫剂量5×106PFU/只，免疫间隔时间3周，共进行3次免疫。整个免疫周期所有的接种动物均未出现不良反应。以上结果表明ALVAC-CDV-M-F-H/C5-免疫效果优于原商品化疫苗，且安全性良好。
本研究表明，基因编辑技术可用于重组金丝雀痘病毒的目标基因缺失与外源基因插入。应用该技术成功获得了可以同时表达CDVM、F、H三种蛋白，并包装形成CDV-VLPs的CDV重组病毒ALVAC-CDV-M-F-H/C5-。免疫结果表明，重组病毒的免疫原性优于母本病毒，可在水貂、狐狸和犬体内诱导产生高水平中和抗体，为野生动物重要疫病专用疫苗研究提供了新的设计思路和技术支持。
第一章：类金丝雀痘样病毒的分离鉴定与遗传进化分析。将2016年3月收集的吉林市松花江风景区捕获的红胁蓝尾鸲皮肤表层的痘斑和损伤皮肤，进行PCR鉴定及测序分析确认其为禽痘病毒感染；将病变组织研磨液接种鸡胚绒毛尿囊膜成功分离获得一株禽痘病毒，电镜观察该病毒具有典型的痘病毒外观形态，命名为APV/03/2016。对病毒的部分P4b和DNApolymerase基因进行分子序列比对，结果表明APV/03/2016的两段基因序列与分离株PacificshearwaterisolatedstrainSWPV-2(KX857215)、CanarypoxvirusstrainD98-11133(GQ487567)、CanarypoxvirusstrainATCCVR-111(AY318871)、AvipoxvirusMississippiisolateP89(KC018048)和AvipoxvirusWisconsinisolateP92(KC018051)的同源性最高。遗传进化分析发现该病毒株隶属于金丝雀痘病毒进化分支(clade B)中的金丝雀痘病毒进化亚分枝(subclade B1)，可初步判定该禽痘病毒为一株类金丝雀痘样病毒。这提示我们新的禽痘病毒宿主如红胁蓝尾鸲正在不断出现，为保护这些潜在的病毒宿主，应加强对禽痘病毒循环和进化的监测。此外，本章研究为后续进行的金丝雀痘病毒疫苗株改造提供了细胞和金丝雀痘病毒培养技术细节方面的参考。
第二章：基于CRISPR/Cas9技术的重组金丝雀痘病毒构建平台的建立。由于传统同源重组法构建重组病毒效率低下，本实验探索并建立一种基于CRISPR/Cas9技术的重组金丝雀痘病毒构建平台。研究中首次利用CRISPR/Cas9技术对ALVAC基因组C5ORF进行编辑，并通过同源性定向修复(Homology Directed Repair，HDR)将荧光标记基因mCherry引入ALVAC基因组，成功构建出一株表达荧光标记蛋白mCherry的重组病毒ALVAC-mCherry-CDV-F-H。CRISPR/Cas9技术的使用相比传统同源重组方法显著提升了重组效率，同时将重组病毒中含有外源DNA的目标重组病毒所占比例从传统方法的1-5%提升到了70-90%。mCherry基因的表达使重组病毒筛选过程可视化，大大缩短了纯化重组病毒的时间。通过对三条靶定C5ORF的gRNA鉴定发现，C5gRNA2编辑效率最高，达到90%，挑选其作为后续试验中引导Cas9工作的gRNA。该平台的成功建立为金丝雀痘病毒载体的利用和重组疫苗的构建提供了可靠的技术支持。
第三章：犬瘟热病毒M基因重组ALVAC的构建及鉴定。为了提升Purevax?FerretDistemper疫苗动物免疫原性，本实验基于病毒样颗粒可能的免疫增强特性对原有疫苗进行修饰。利用CRISPR/Cas9技术结合先期建立的重组金丝雀痘病毒构建平台，在ALVAC基因组C5ORF位点形成DNA双链断裂(DSB)，并通过同源性定向修复将CDV-M基因及mCherry基因插入ALVAC基因组，同时替换掉C5ORF，成功构建重组病毒ALVAC-CDV-M-F-H/C5-。通过对筛选纯化获得的ALVAC-CDV-M-F-H/C5-进行PCR、噬斑滴定、WesternBlot及电镜等鉴定，结果表明，拯救病毒的复制能力与母本病毒相当，且能够同时表达CDV-M、F和H蛋白并成功组装CDV-VLPs，组装的CDV-VLPs能够被释放到细胞培养上清中。该研究进一步验证了利用基因编辑技术平台改造病毒的可行性，同时为犬瘟热候选疫苗的研究提供了新的设计思路和物质储备。
第四章：重组病毒在不同动物体内的免疫原性评估。为了评价重组病毒对动物的免疫效果及安全性，将ALVAC-CDV-M-F-H/C5-、ALVAC-CDV-F-H分别接种了狐狸、水貂和犬，并设立了空白对照组，对诱导产生的免疫应答进行了检测和分析。免疫结果显示ALVAC-CDV-M-F-H/C5-和ALVAC-CDV-F-H均能够有效的诱导狐狸、水貂和犬产生特异性中和抗体，而前者在免疫初期的抗体阳性率更高，可诱导产生更高水平的中和抗体，与ALVAC-CDV-F-H存在统计学上的显著性差异。通过比较中和抗体滴度，确定ALVAC-CDV-M-F-H/C5-的最佳免疫程序为：肌肉注射途径免疫，免疫剂量5×106PFU/只，免疫间隔时间3周，共进行3次免疫。整个免疫周期所有的接种动物均未出现不良反应。以上结果表明ALVAC-CDV-M-F-H/C5-免疫效果优于原商品化疫苗，且安全性良好。
本研究表明，基因编辑技术可用于重组金丝雀痘病毒的目标基因缺失与外源基因插入。应用该技术成功获得了可以同时表达CDVM、F、H三种蛋白，并包装形成CDV-VLPs的CDV重组病毒ALVAC-CDV-M-F-H/C5-。免疫结果表明，重组病毒的免疫原性优于母本病毒，可在水貂、狐狸和犬体内诱导产生高水平中和抗体，为野生动物重要疫病专用疫苗研究提供了新的设计思路和技术支持。