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前言 肿瘤是一类常见的严重危害人类健康的体细胞遗传病，其发生率和死亡率均呈逐年上升的趋势，恶性肿瘤已成为人类致死的最主要的原因之一。目前研究的结果表明肿瘤是细胞中多种基因突变积累的结果，这些基因突变主要发生在3类基因，即癌基因(oncogene)，肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)，DNA错配修复基因(DNA mismatch repair gene)。其中绝大多数肿瘤的基因都是体细胞变异，包括突变，扩增，重排，缺失或甲基化状态的改变。 肿瘤的发生是一个多基因参与的，多阶段的复杂过程。癌基因，肿瘤抑制基因的发现促进了对细胞周期及细胞凋亡机制的深入理解。使人们对肿瘤发生和发展的认识也日趋深入。探讨不同类型肿瘤相关基因是认识肿瘤发生分子机理，开展基因诊断和基因治疗的基本前提。90年代初期，针对癌基因和肿瘤抑制基因研究中出现的问题，特别是单个基因分析的局限性，提出了人类基因组研究，尤其是癌基因组解剖计划(Cancer Genome Anatomy Project,CGAP)的全面启动，力求从根本上阐明肿瘤发生的分子机制，并提出有效的干预和治疗措施。我国根据自己的具体国情，需求和优势，紧紧围绕基因组计划，积极开展肿瘤相关基因的克隆，定位工作。 胃癌在我国是造成死亡人数最多的恶性肿瘤，每年死于胃癌的人数约16万人，近年来其发病率有上升趋势，严重地威胁着广大人民的健康。阐明胃癌发生和发展的分子机理进而指导肿瘤防治，在我国有特殊的重要性和迫切性。 同其他恶性肿瘤一样，胃癌的发生也是由多因素参与，并经历了多阶段的演变过程，涉及到多种癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活。通过研究使我们认识到，胃癌发生发展的关键是正常细胞的基因组发生了改变，自发性、化学物理性，以及病毒性致癌因素只是诱因，而基因改变才是导致细胞生长发育的正负调控和功能紊乱的分子基础。因此，开展胃癌相关基因的克隆和鉴定工作，是我国围绕基因组计划开展的一项重要具体工作，具有重要的意义。 本文采用染色体杂合性丢失研究门oss of heterozygosity，LOH入筛查胃癌相关单个基因的突变以及抑制性消减杂交（suppressed sub咖hve hybriza－dhon，SSH）的方法发现并鉴定胃癌的相关基因，将为胃癌的深人研究打下基础。 材料和方法 胃癌标本来源于中国医科大学附属第一临床学院肿瘤科患者，手术切取胃癌组织及距癌组织1厘米以上的癌旁正常组织。手术切取胃癌组织及癌旁正常组织均经病理证实。 二．18号染色体的杂合性丢失分析 选择 18号染色体的 9对短插N缺失多态Khort Insenion Delehon POI．ymorphism，SIDP）标记，以激光捕获显微切割（oerp CaPtllte Mrpc。diSSechon，LCM）－高可信度全基因组扩增汕ishfidelity－whde s。ome mpmpcation，HF－WGA）－变性高效液相色谱（Denaturing Hi吵庄formance 11…d Cbo－matograPhy，D－）联合技术进行 LOH的分析，与癌旁正常组织相比，癌组织DNA的PCR扩增产物的DHPLC色谱峰数目减少或色谱峰相对高度减少50％以上判定为LOH，所有阳性病例应用变性聚丙烯酚胺凝胶电泳加硝酸银染色证实。 2．KLF基因的突变分析 联合应用PCR和DHPLC技术对35例胃癌患者组织进行KLF基因编码区全部外显子序列突变筛查。与正常组织的色谱峰型进行比较，在部分变性温度条件下，相应肿瘤组织色谱峰的个数和峰的对称性改变，如出现肩峰及不对称峰，说明有变异发生。将此PCR产物纯化后测序，然后与基因库序列比较确定变异性质。 3．BRAF基因V599E位点突变分析 采用传统的限制性片段长度多态性（restriction agmen length polylnon ·2·phism，iiLP）标记分析方法，即运用两次PCR反应得到大量纯化的包含有BRAF基因第 1796位核耷酸的产物，用Taa限制性核酸内切酶酶切后，通过聚丙烯囚胺凝胶电泳进行片段分离。对经酶切后能产生59hP酶切片段的第H轮PCR产物用TaKaRa公司的PCR产物纯化试剂盒进行纯化后送TaKaRa公司测序确定突变。 4．抑制消减杂交方法筛查青年人胃癌相关基因 采用TRIZOI试剂分别提取青年人胃癌及癌旁正常组织的总RNA，用CLONTECH公司 SMARTmPCR cDNA Srpthesis Li分别合成青年人胃癌及癌旁正常组织的双链cDNA，用 CLONTECH公司 CLONTECH PCR－Select—cDNA Subtrachon it进行 SSH，将 SSH产物片段与 pMD18－T载体连接，转化大肠杆菌JM109后以菌落PCR方法鉴定插人片段大小，并对部分菌落进行测序，测序结果在国际互联网上进行同源性比较和分析。 结 果 1．18号染色体的杂合性丢失分析 有3例胃癌组织的MID150位点的PCR产物的DHPLC峰型呈现LOH（30呢）。其中二例同时在另夕2个SIDP位点（MID148、MID352）DHPLC色谱峰型也呈现LOH。9个位点中有6个位点（MID24，MID25，MID149，MID151，MID298，MIm87）的 PCR产物的 DHPLC色谱峰型未见异常。