糖尿病已经成为仅次于恶性肿瘤的对人类健康危害极大的慢性疾病,传统的药物治疗并不能改变糖尿病的进程,胰腺移植和胰岛移植给糖尿病的治愈带来了曙光,然而供体细胞来源不足和移植物免疫排斥问题阻碍了其进一步推广,寻找新的移植源细胞显得非常重要。骨髓间充质干细胞(BMSCs)因具有取材方便、来源丰富、具有巨大的多向分化潜能、易于被外源性基因转染等特点,使其成为理想的种子细胞,因此以自体分离出BMSCs为种子细胞,在体外培养,大量扩增以达到足够量的细胞,通过组织工程改造制备出类β细胞,再自体移植到糖尿病个体体内,或将成为有效的解决供体缺乏和免疫排斥的新途径。本研究分离出小鼠的BMSCs,在体外扩增培养,通过多细胞因子诱导法、共培养诱导法、转胰岛素基因和转PDX-1、NeuroD1和MafA基因等四种途径将BMSCs制备成类β细胞,比较四种途径的特点,并移植到糖尿病小鼠模型不同的器官,选出最佳的移植部位,进一步将大型实验动物毕格犬的BMSCs制备成类β细胞,借助肝脏介入技术将其自体移植到糖尿病毕格犬体内,观察其长期疗效和生物安全性。整个研究分为四个部分。第一部分骨髓间充质干细胞诱导为类β细胞的研究目的：诱导法将BMSCs制备成类β细胞；方法：通过体外分离、培养小鼠的骨髓间充质干细胞,获取大量的种子细胞,运用细胞因子诱导剂诱导和共培养诱导,将骨髓间充质干细胞诱导分化为类β细胞,并观察它的体外生物学特性；结果：两种方法均能诱导出类β细胞,均有胰岛素分泌,细胞因子诱导法诱导出类β细胞对葡萄糖刺激胰岛素分泌有反应,但两种方法制备出的类β细胞产量均较低；结论：多细胞因子诱导法诱导BMSCs制备的类β细胞在功能上更加接近β细胞。第二部分骨髓间充质干细胞转基因制备类β细胞的研究目的：转基因法将BMSCs制备成类β细胞；方法：通过逆转录病毒载体将外源性胰岛素基因转入小鼠骨髓间充质干细胞,使其表达外源性胰岛素基因,获得分泌胰岛的类β细胞；通过腺病毒载体将PDX-1、NeuroD1及MafA基因转导入小鼠骨髓间允质干细胞,刺激内源性的胰岛素基因的表达,获得类β细胞,比较两种途径制备类p细胞的效果;结果：转胰岛素基因制备的类β细胞能够分泌胰岛素,制备效率高,但对葡萄糖刺激无反应,转PDX-1、NeuroD1及MafA基因制备的类β细胞既能分泌胰岛素也能对葡萄糖刺激产生反应,但制备效率较低；结论：两种转基因法均能制备出类p细胞,但转胰岛素基因法制备的类p细胞的功能有待进一步提高,转三基因法制备出的类p细胞在功能上与p细胞更加接近,但需提高制备效率。第三部分类β细胞移植部位选择及在体内分布的研究目的：研究类p细胞移植的最佳部位及其在体内分布情况；方法：将前部分实验获得转胰岛素基因的类β细胞分别移植入糖尿病小鼠模型的肝脏、肾脏、胰腺、脾脏及尾静脉。移植后监测对比各组糖尿病鼠的血糖、体重、IPGTT、胰岛素水平,并对移植受体器官进行组织切片和免疫组化分析,选择出最佳移植部位,并通过尾静脉移植GFP小鼠MSCs,观察其在糖尿病模型体内的分布情况；结果：肝脏移植组血糖下降、体重增加、IPGTT、血清胰岛素水平均优于其它器官移植组,尾静脉移植后,细胞向胰腺等器官分布；结论：肝脏是进行类β细胞体内移植的理想部位,MSCs移植到糖尿病小鼠体内,有向着胰腺等器官归巢分布的趋势。第四部分自体肝内移植类β细胞对Beagle犬糖尿病长期疗效及安全性研究目的：研究类β细胞自体肝内移植对糖尿病Beagle犬的长期疗效及安全性；方法：通过构建pMSCV-Ins-EGFP双表达重组逆转录病毒载体,转染Beagle犬BMSCs,制备类p细胞,运用肝动脉介入技术,将类p细胞自体移植入糖尿病毕格犬肝内,通过监测比较糖尿病Beagle犬移植前后各项生理指标,评价其是否具有长期稳定的治疗效果,同时进行肝脏生理功能及病理组织形态学检测,并对生物安全性进行验证；结果：自体移植类p细胞治疗糖尿病毕格犬,血糖、体重、胰岛素水平均有明显改善,且疗效持续80周以上,毕格犬的肝功能正常,移植部位的肝脏未发现肿瘤形成,具有可靠的生物安全性;结论：自体肝内移植类p细胞对Beagle犬糖尿病有长期疗效且具有相对可靠的生物安全性,微创介入自体肝内移植是一种理想的移植途径。