论文部分内容阅读
背景和目的:免疫微环境在肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用，TNF-α为关键调节分子，通过上调Erk、NF-κB通路诱导MMPs的表达最终导致肿瘤细胞的侵袭和迁移能力的增加，但肝癌中这一机制并不明确。TIPE2是一个免疫负调控基因，可抑制淋巴细胞F-actin的解聚及平滑肌细胞MMP-9的表达从而抑制细胞的迁移，此外肝癌的临床标本中也发现癌组织中的TIPE2表达明显低于癌旁组织，表明TIPE2有可能在抑制肝癌的迁移过程中发挥重要作用。因此，本实验主要研究TNF-α对HepG2迁移能力的影响相关机制及TIPE2对TNF-α所引起的现象及机制。
方法:首先采用Transwell、Western blot、Real-time PCR等实验研究TNF-α对HepG2细胞迁移能力的影响及迁移相关MMP-3/MMP-13的表达情况;其次以Western blot、免疫荧光激光共聚焦、Transwell等实验检测TNF-α所诱导的NF-κB、Erk通路对调控MMP-3/MMP-13表达变化及对HepG2细胞迁移能力的影响;再次以Transwell、Western blot、RT-PCR、Real-time PCR等方法研究TIPE2过表达对HepG2细胞迁移能力及相关MMP-3、MMP-13表达影响;继以Western blot、免疫荧光激光共聚焦等方法探究TIPE2过表达对Erk/c-Fos、NF-κB通路激活影响;最后，以流式细胞术、Western blot、RT-PCR等方法研究LPS对HepG2细胞产生TNF-α的影响。
结果:1、TNF-α刺激可使肝癌细胞HepG2迁移能力增强近一倍、迁移相关MMP-3/MMP-13转录在2 hrs和24 hrs分别上调7.29和8.58倍、MMP-3/MMP-13表达水平分别在0.5-24 hrs和5 min-24 hrs持续性激活;2、TNF-α刺激可于5-120min持续激活HepG2细胞Erk/c-Fos、p65、IκBα，NF-κB通路、Erk通路抑制剂可抑制TNF-α对MMP-3/MMP-13的转录上调作用，且NF-κB通路、Erk通路抑制剂对TNF-α所增强的HepG2细胞迁徙能力分别抑制94.8％和82.8％;3、TNF-α所增强的HepG2细胞迁徙能力、MMP-3和MMP-13转录可因TIPE2过表达而分别抑制50％、61.8％和83.8％;4、TIPE2过表达可抑制TNF-α所诱导的HepG2细胞Erk、IκBα、p65的磷酸化及c-Fos的表达;5、LPS刺激可使TNF-α在4-24hrs转录表达持续激活，TNF-α的阳性细胞百分率和平均荧光密度(MFI值)分别增加126％、35.5％。
结论:上述结果提示:在HepG2细胞中，TNF-α可通过激活NF-κB、Erk通路上调MMP-3/MMP-13表达进而增强其细胞迁移能力;TIPE2过表达可通过明显抑制TNF-α所诱导的NF-κB、Erk/c-Fos通路激活，下调TNF-α所增强的MMP-3、MMP-13表达从而降低了炎症因子TNF-α对肝癌HepG2细胞迁移能力的增强作用。提示TIPE2可能在肝癌转移中发挥负调控的作用，为临床肝癌治疗提供新的潜在靶点。