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目的1.分离、培养和鉴定人外周血B淋巴细胞和眼眶成纤维细胞,复合培养两细胞,建立起具有自身免疫特性的甲状腺相关眼病(TAO)体外复合培养的细胞模型。为进一步研究B细胞和眼眶成纤维细胞之间的相互作用,且证明B细胞在TAO的发病机制中起到一定的作用奠定基础。2.通过体外观察眼眶成纤维细胞胰岛素生长因子-1受体(IGF-1R)的表达,动态、定量检测复合培养细胞模型中炎性细胞因子和趋化因子的表达,探讨TAO可能的发病机制。3.通过应用B细胞抑制剂利妥昔单抗(Rituximab, RTX)和IGF-1R的结合蛋白,调控复合培养细胞模型中的炎性细胞因子和趋化因子,从而探讨TAO细胞学和分子生物学不同水平上的发病机制,为临床治疗提供新的思路。方法1.原代培养15例TAO患者及15例正常人的眼眶成纤维细胞,免疫组化法鉴定其性质,MTT法描绘细胞生长曲线；用免疫磁珠分离外周血技术+CpG刺激+细胞培养法,纯化、培养10例TAO患者及10例正常人的外周血B淋巴细胞,流式细胞术鉴定其性质及纯度。按成纤维细胞与B细胞1：20的比例建立复合培养细胞模型。2.流式细胞仪及共聚焦显微镜观察比较正常人和TAO患者眼眶成纤维细胞IGF-1R的差别。ELISA法比较各组复合培养细胞模型24h、48h、72h炎性细胞因子IL-6和趋化因子RATNTES的表达。3.MTS法比较不同作用浓度及不同作用时间B细胞抑制物RTX对B细胞的抑制作用；ELISA法观察RTX和IGF-1R结合蛋白作用于复合培养细胞后对IL-6和RANTES表达的抑制作用。结果1.体外成功培养并鉴定了眼眶成纤维细胞及外周血B淋巴细胞,建立了TAO复合培养细胞模型。2.流式细胞术和共聚焦显微观察均发现TAO患者的眼眶成纤维细胞上IGF-1R的表达明显高于正常人。3.24h复合培养各实验组的IL-6和RANTES的表达均升高,其中T+T组(甲状腺相关眼病患者的B淋巴细胞与患者的眼眶成纤维细胞复合培养组)的IL-6和RANTES水平最高。4.用RTX、IGF-1R结合蛋白作用于T+T组复合培养的细胞模型,在48h上清液中检测到的炎性细胞因子IL-6和趋化因子RANTES的浓度明显降低。结论1.本课题建立的TAO眼眶成纤维细胞和B淋巴细胞复合培养的模型,对自身免疫性疾病有一定的针对性,证明了B淋巴细胞与眼眶成纤维细胞之间的相互作用在TAO的发病机制中起到一定作用。2.IGF-1R可能是OF和B细胞的作用通路,IGF-1R介导了GD和TAO的发展,阻滞IGF-1R可以降低TAO的局部炎症反应。3. B细胞抑制药物RTX在TAO中的应用,可能对抑制疾病局部的炎症反应有一定作用,这可能成为TAO治疗的新途径。