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目的流行病学调查表明,大约有10%～30%的癌症患者发生肿瘤脑转移,我国每年的新增脑转移瘤病例大约为1.7万。在各种脑转移肿瘤中以肺癌脑转移居多,约占全部病例的30%,其中小细胞型肺癌(small cell lung cancer, SCLC)具有恶性度高,脑转移发生时间早的特点。大约有50%的小细胞肺癌患者发生脑转移,其中有10%～20%的患者以脑部转移瘤形成为疾病的首发症状,而80%的患者在确诊后两年发生脑转移,病人的致死、致残率高,预后差。因此,探讨小细胞肺癌脑转移的分子机制对于小细胞肺癌的防治具有重要的意义。肿瘤转移是一个复杂多步骤的病理过程,器官血管壁的通透性将影响肿瘤细胞的转移。脑的血管系统具有特殊的血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)结构,这个屏障在一定程度上可以阻止致病因子对脑的侵害,但是小细胞肺癌向器官转移表现出对脑的“亲嗜性”,这一病理特点提示小细胞肺癌可能具有影响血脑屏障通透性的肿瘤特性。近年的研究发现了一些与小细胞肺癌骨转移相关的基因(如Prepro GRP和NMB-R),并且发现其转移与肺癌细胞表面的酪氨酸激酶受体活性增高有关。本室研究发现,在小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMEC)过程中激活了Rho/ROCK通路,使actin细胞骨架重排,破坏HBMEC间紧密连接(tight junction, TJ)的完整性,从而促进小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障(FEBS letters,2006,580:4252-4260).近年来,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)与恶性肿瘤的关系受到重视,发现恶性肿瘤组织VEGF表达上调,不仅能促进肿瘤血管形成、促进肿瘤生长,还能通过促进血管的渗透性来加速肿瘤组织细胞进出血管,因而加速了肿瘤的转移。胎盘生长因子(placental growth factor, PLGF)是血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族中的一员,多在病理条件下发挥生物学功能。在肿瘤研究中发现,PLGF主要通过促进肿瘤血管的新生而影响肿瘤的增殖。PLGF可以通过与VEGFR-1/Flt-1受体结合,协同VEGF发挥血管生成的作用。此外,还可以募集循环中的造血干细胞和单核细胞到肿瘤原发灶,促进肿瘤血管的增殖。近来的研究表明,PLGF在肿瘤发生中具有双重作用,一可以直接作用于肿瘤细胞而影响肿瘤细胞的迁移,二可以作用于血管内皮细胞影响其功能。本室进一步研究发现PLGF在小细胞肺癌细胞穿过BBB过程中发挥了重要作用,其与脑微血管内皮细胞上的VEGFR-1/Flt-1受体相结合,引发下游信号通路,激活Rho/ROCK通路,进一步使细胞骨架系统重排、紧密连接破坏,从而使肿瘤细胞穿过血脑屏障。本研究主要是在前期研究的基础上通过动物实验进一步验证PLGF是否在SCLC穿过血脑屏障过程中发挥了作用。方法1、RT-qPCR检测PLGF在不同肺癌细胞中的表达情况2、利用体外血脑屏障模型,比较六种肺癌细胞穿过HBMEC单层的情况3、利用RNAi技术,构建以腺病毒为载体的siPLGF表达系统,获得病毒颗粒(1)含目的基因(si PLGF)穿梭子(shuttle)的构建①构建双链si PLGF:双链短发夹oligo DNA退火连接②线性化shuttle空载体与双链si PLGF的连接③重组质粒的转化、筛选和鉴定(2)腺病毒的重组①线性化载体shuttle (si PLGF)②shuttle和pAdEasy腺病毒载体共转化细菌BJ5183③重组子的筛选和鉴定④重组子(Ad-shuttle-siPLGF)的大量扩增(3)病毒颗粒的包装①AD293细胞的培养②初级病毒颗粒的形成③二级病毒颗粒的形成④三级病毒颗粒的形成⑤病毒颗粒滴度的测定4、Ad-si-PLGF感染3种SCLC,检测其穿过HBMEC单层的情况(1)腺病毒感染3种SCLC(2) RT-qPCR鉴定PLGF-siRNA干扰效果(3)检测感染后的SCLC穿过HBMEC单层的情况5、体内实验(1)经心室内途径接种肺癌细胞,分析不同肺癌细胞在动物体内的成瘤特性①接种前细胞的处理②分别经心室内途径接种6种肺癌细胞③观察脑内和肺部的成瘤情况(2)颈内动脉接种腺病毒感染的SCLC①腺病毒感染3种SCLC②分别经颈内动脉途径接种感染SCLC③观察脑内和肺部的成瘤情况结果1、PLGF在不同肺癌细胞中的表达情况RT-qPCR检测不同肺癌细胞中PLGF的表达,NCI-H 250(来源于小细胞肺癌脑转移灶)和NCI-H209(来源于小细胞肺癌骨髓转移灶)两株小细胞肺癌细胞PLGF高表达；而NCI-H446(来源于小细胞肺癌胸水渗漏的细胞)则PLGF表达较低。而A 549、NCI-H460和NCI-H292低表达PLGF。结果表明：PLGF可能与肿瘤转移相关,而且与脑转移相关性大。2、利用体外血脑屏障模型,比较六种肺癌细胞穿过HBMEC单层的情况利用体外血脑屏障模型,检测CFSE荧光染色的六种肺癌细胞穿过HBMEC单层的情况,三种小细胞肺癌细胞(NCI-H250、NCI-H209、NCI-H 446)穿过数明显高于非小细胞肺癌(A 549、NCI-H460、NCI-H292)。3、构建以腺病毒为载体的siPLGF表达系统,获得病毒颗粒(1)成功构建了携带短发央si PLGF的穿梭载体：shuttle (si PLGF),并与腺病毒骨架载体成功重组,获得腺病毒RNAi重组子(Ad-shuttle-si PLGF)。(2)完成AD 293细胞三次病毒包装并获得了病毒颗粒,含量为1.5×1011viruses。4、Ad-si-PLGF感染3种小细胞肺癌细胞,检测其穿过HBMEC单层的情况(1)腺病毒感染NCI-H250、NCI-H209、NCI-446三种细胞。(2) RT-qPCR检测腺病毒感染的3种小细胞肺癌细胞PLGF, Ad-si-PLGF组的PLGF表达明显少于两个对照组。(3)与感染Ad-shuttle-vector和Ad-shuttle-scramble的细胞相比,PLGF沉默的SCLC穿过HBMEC单层的细胞数明显减少。5、体内实验(1)经心室内接种6种肺癌细胞,在动物体内成瘤性有明显差异NCI-H446和NCI-H460细胞成瘤性最好,NCI-H292和A549细胞成瘤性较好,而NCI-H 209和NCI-H 250细胞则成瘤性较差。六种肺癌细胞在肺部均可见成瘤,但未发现一例脑内转移瘤。(2)颈内动脉接种腺病毒感染的SCLC成瘤情况三种小细胞肺癌细胞具有不同的脑转移能力,NCI-H209的脑内成瘤机会更高些,小细胞肺癌细胞脑转移瘤主要发生在脉络丛及脑皮质层等血运丰富部位。与对照组相比,PLGF沉默的SCLC无一例发生肺癌脑转移,PLGF可能参与了SCLC穿过血脑屏障转移入脑这一过程。结论PLGF参与小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障转移入脑的过程。