【摘 要】
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目的:（1）明确潜在转化生长因子β结合蛋白4（LTBP4,latent-transforming growth factor beta-binding protein 4）基因在胃腺癌中的表达及与生存率的关联。（2）明确LTBP4表达的变化对胃腺癌生物学功能的影响,并探讨其作用机制。方法:（1）在TCGA-STAD数据库中,检测LTBP4在正常胃粘膜组织与胃腺癌组织中的表达。在本院的样本中,分别使
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目的:（1）明确潜在转化生长因子β结合蛋白4（LTBP4,latent-transforming growth factor beta-binding protein 4）基因在胃腺癌中的表达及与生存率的关联。（2）明确LTBP4表达的变化对胃腺癌生物学功能的影响,并探讨其作用机制。方法:（1）在TCGA-STAD数据库中,检测LTBP4在正常胃粘膜组织与胃腺癌组织中的表达。在本院的样本中,分别使用QPCR与western blot检测LTBP4在胃腺癌组织与正常胃黏膜组织中的表达。并从数据库中调取总体生存信息,发现生存差异。（2）设计CON与LTBP4过表达载体,并包装为慢病毒。胃癌细胞系MKN-45分为CON与LTBP4组,分别感染CON与LTBP4过表达慢病毒48h,使用流式细胞仪检测感染效率,QPCR与western blot检测LTBP4在m RNA与蛋白水平的过表达效率。并使用Annexin V APC/PI双染法检测细胞凋亡的改变、CCK8法检测细胞增殖的变化、PI染色法检测细胞周期的变化,以及皮下荷瘤实验检测肿瘤体内增殖的变化。（3）在TCGA-STAD数据集中,检测LTBP4低表达样本中通路的富集变化。使用western blot检测CON与LTBP4组转化生长因子β1（TGF-β1,transforming growth factor beta 1）的表达、TGF-β1下游信号通路Smad3磷酸化的变化。MKN-45细胞系分为CON与LTBP4-sh RNA组,并分别感染CON与LTBP4-sh RNA慢病毒48h后,使用western blot与QPCR检测蛋白与m RNA敲低水平的变化,使用ELISA检测总体、激活状态的TGF-β1的分泌变化。（4）MFC细胞分为CON与LTBP4-sh RNA组,分别感染CON与LTBP4-sh RNA慢病毒,并注射入615小鼠皮下。2周后收集原位肿瘤并得到单细胞悬液,通过流式细胞仪检测其中PMN-MDSC与MO-MDSC的改变,Cytof检测MDSC、CD8 T细胞的改变。收集CON与LTBP4-sh RNA组细胞上清,与MDSC、CD8 T细胞共培养后,检测T细胞增殖的改变。（5）LTBP4-sh RNA注射入615小鼠皮下后,分为LTBP4-sh RNA组、SB431542组,随后分别注射PBS、TGF-β1抑制剂SB431542,并监测肿瘤体积改变,同时使用流式细胞仪检测原位肿瘤中PMNMDSC与MO-MDSC的改变,Cytof检测MDSC、CD8 T细胞的改变。而MFC细胞在经过SB431542处理后,收集细胞上清,并与MDSC、CD8 T细胞共培养后,检测T细胞增殖的改变。结果:（1）在TCGA-STAD数据库中,LTBP4低表达于胃腺癌组织中,且与患者总体生存率相关。在本院样本中,相对于正常胃黏膜组织,LTBP4低表达于胃腺癌组织中。（2）在胃癌细胞系MKN-45中过表达LTBP4后,细胞凋亡显著增加,增殖受限,细胞周期则出现了G1期阻滞,同时MKN-45的体内增殖能力下降。（3）通过调控网络分析,LTBP4的表达与TGF-β1相关。在LTBP4低表达的肿瘤样本中,TGF-β1分泌、激活相关通路高度富集,而在LTBP4过表达的细胞系中,TGF-β1、TGF-β1 I型、II型受体、Smad3、磷酸化Smad3均显著降低。同时在LTBP4低表达的细胞的上清中,总体、激活状态下的TGF-β1分泌显著增加。（4）CON与LTBP4-sh RNA组MFC细胞注射入615小鼠后,LTBP4-sh RNA组原位肿瘤中PMN-MDSC、MO-MDSC比例显著上升,CD8 T细胞比例显著下降。在LTBP4-sh RNA组MFC细胞上清与MDSC、CD8 T细胞共培养后,结果表明T细胞增殖水平显著下降。（5）615小鼠在注射SB431542后,原位肿瘤体积减小,且PMN-MDSC与MO-MDSC的比例下降。而MFC在经过SB431542处理后,得到的上清液与MDSC、T细胞共培养,结果表明T细胞增殖能力显著上升。结论:LTBP4在肿瘤细胞中的表达水平显著下调,且LTBP4的过表达能够促进肿瘤细胞的凋亡、细胞周期G1期阻滞,并抑制体内增殖。而肿瘤细胞中LTBP4水平的降低不仅能够促进TGF-β1的分泌,还能够增加肿瘤微环境中PMN-MDSC、MOMDSC的比例,增强MDSC对T细胞增殖的抑制。因此,我们推断LTBP4在胃癌的发生、发展中扮演了重要的角色。
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