阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经系统退行性病变,其病因及发病机制尚未完全清楚,其治疗尚无重大进展。研究显示,AD患者大脑中存在大量Aβ尤其是Aβ42沉积,是诱发和促进AD病理发展的关键因素之一。Aβ42神经毒性机制尚未完全清楚,研究认为其毒性作用与氧化应激以及炎症反应有关,因此,针对Aβ42诱导的氧化应激与炎症反应的干预有一定前景。毛蕊异黄酮(Calycosin)提取自中国传统中药黄芪,研究表明其具有抗氧化、改善循环和免疫调节活性,对改善、预防和治疗糖尿病相关的认知缺陷具有有益的作用。相关研究证实部分黄酮类化合物对AD具有治疗作用,但毛蕊异黄酮是否可以减轻Aβ诱导的神经毒性对AD起到治疗作用尚未见研究报道。本实验从氧化应激及炎症反应角度,以PKC/Nrf2信号通路为靶点,对毛蕊异黄酮在AD模型中的神经保护作用进行以下3部分研究。第一部分:毛蕊异黄酮减轻Aβ诱导的氧化应激与炎症反应本部分研究中,在体外观察毛蕊异黄酮对Aβ42暴露下PC12细胞氧化应激、炎症反应和细胞活性的影响。通过DCFH-DA检测发现,经Aβ42刺激之后PC12细胞内绿色荧光表达增强,表明Aβ42可诱导PC12细胞中活性氧类(ROS)的大量生成。而毛蕊异黄酮可减轻PC12细胞中ROS含量,下调Aβ42引起的线粒体膜电位损害效应。并且毛蕊异黄酮可上调SOD活性并下调MDA水平。此结果表明毛蕊异黄酮具有减轻Aβ42所致PC12细胞内氧化应激的作用。通过q RT-PCR和ELISA检测发现,在加入Aβ42后,PC12细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β表达量明显增加。而通过毛蕊异黄酮预处理后,Aβ42诱导PC12细胞炎症因子的表达和释放明显减少,且呈剂量依赖性,说明毛蕊异黄酮在体外可以减轻Aβ42诱导的神经炎症反应。本部分研究的最后,通过CCK-8和LDH活性检测以及凋亡检测,发现毛蕊异黄酮可减轻Aβ42介导的细胞损伤和凋亡作用。综上,本研究结果显示,毛蕊异黄酮可通过减轻Aβ42诱导的氧化应激和神经炎症反应,对Aβ42暴露的PC12细胞起到保护作用。但毛蕊异黄酮是通过何种机制发挥神经保护作用的尚未完全清楚。本研究进一步通过体内和体外实验,以PKC/Nrf2信号通路为作用靶点,对毛蕊异黄酮的抗氧化和抗炎症作用进行探讨。第二部分:毛蕊异黄酮通过PKC/Nrf2信号通路调控炎症反应和氧化应激本部分研究中,使用RNA干扰技术和信号通路特异性抑制技术作用于PKC/Nrf2信号通路,探讨毛蕊异黄酮抗氧化和抗炎作用机制。研究发现无论是低剂量还是高剂量的毛蕊异黄酮均对PC12细胞中Nrf2表达无明显影响,但经过毛蕊异黄酮刺激后,细胞核内Nrf2表达明显增加,并随毛蕊异黄酮剂量的增加更为明显,表明毛蕊异黄酮可促进Nrf2向核内转移。为观察Nrf2是否参与毛蕊异黄酮抗氧化和抗炎能力,本文做了进一步研究。结果显示,RNA干扰技术敲除PC12细胞中的Nrf2后,毛蕊异黄酮抗氧化和抗炎能力明显被削弱,并且对Aβ暴露下的PC12细胞的保护能力也下降。PKC特异性抑制剂calphostin C对PC12细胞进行预处理后,观察毛蕊异黄酮对Nrf2激活的影响。结果显示,calphostin C抑制毛蕊异黄酮的促Nrf2转核能力。并且,calphostin C还会抑制毛蕊异黄酮对Aβ诱导的PC12细胞膜电位和MDA水平以及炎症因子TNF-α和IL-1β的影响,削弱毛蕊异黄酮对细胞活性和凋亡的保护作用。综上,本部分研究结果显示,毛蕊异黄酮可通过PKC信号通路促进Nrf2的激活,发挥抗氧化和抗炎能力从而对Aβ暴露下的PC12细胞起到保护作用。然而,体外研究并不能充分说明毛蕊异黄酮对AD的治疗作用。因此,在下一部分研究中将进一步观察并探讨毛蕊异黄酮对APP/PS1小鼠脑内氧化应激和炎症反应以及记忆学习能力的影响。第三部分:毛蕊异黄酮对APP/PS1小鼠认知功能损害的影响本部分研究中,以APP/PS1小鼠作为研究对象,观察并探讨毛蕊异黄酮在体内抗氧化、抗炎和神经保护作用及机制。实验测试了在3种不同剂量毛蕊异黄酮对转基因AD小鼠行为学和神经病理的影响。结果显示,与正常小鼠相比,APP/PS1小鼠学习和记忆明显受损,海马中Aβ和tau蛋白沉积,促炎介质(IL-1β和TNF-α)和氧化应激标志物MDA水平上升,而抗氧化物质GSH活性下降。给予毛蕊异黄酮可改善APP/PS1小鼠的学习和记忆能力,并呈剂量依赖性。并且,毛蕊异黄酮可明显减轻小鼠海马中炎症因子IL-1β和TNF-α的表达,减轻氧化应激水平。此外,给予PKC抑制剂calphostin C可抵消毛蕊异黄酮改善APP/PS1小鼠认知能力、抗氧化和抗炎等神经保护作用。综上,本部分研究显示在动物模型中,毛蕊异黄酮通过PKC通路的激活减轻AD小鼠海马中氧化应激水平和炎症反应,从而改善AD小鼠认知功能起到神经保护作用。