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本论文以腺苷为研究对象,以多尺度理论为指导,从基质代谢和产物合成,基因表达谱分析,代谢通量分析等方面对腺苷合成的过程优化进行了研究,为进一步提高腺苷产量提供了理论依据和新的研究思路。
使用实验设计法对腺苷生产培养基的组分进行了优化。发现KH<,2>PO<,4>和L-谷氨酸对腺苷的合成有促进作用,高浓度的蔗糖和酵母粉对腺苷合成不利,氮源之间有交互作用。以优化后的培养基发酵,腺苷产量达到7.42g/L,比优化前提高28.6%。
研究了青霉素和氯霉素以及表面活性剂对腺苷合成的影响,发酵中后期添加这些物质能够提高腺苷产量。42h添加20μg/mL的青霉素,腺苷产量比对照提高25.1%;56h添加10g/L的Tween80,腺苷产量比对照提高28.1%。
多尺度研究了谷氨酸对腺苷生物合成的促进作用。谷氨酸降解生成大量的α-酮戊二酸,补充了TCA循环中有机酸的供应,节省了葡萄糖经EMP途径进入TCA循环的代谢流,能够使更多的碳源流向HMP途径。添加谷氨酸使细胞内NAD<+>浓度升高,产酸减少。通过代谢通量分析,证实添加谷氨酸能够提高TCA循环的流量,增加HMP途径的相对流量,腺苷合成流量增加。添加谷氨酸的发酵后期,大量碳骨架经糖异生途径进入HMP途径。
建立了枯草杆菌的寡核苷酸基因芯片研究技术,并比较了发酵16h时添加谷氨酸对基因表达谱的影响。添加谷氨酸使糖异生途径的基因ftp表达水平提高了1.7倍,控制有氧和厌氧呼吸的双组分调节蛋白基因resD表达提高2.1倍。应激反应的RNA聚合酶编码基因sigB的表达下调2.2倍,代谢溢流相关基因alsS等下调3倍左右。除了柠檬酸合成酶表达下降以外,中心途径的糖酵解途径、TCA循环和HMP途径的基因表达变化不大。该结果与代谢通量分析的结果基本一致。
以多尺度微生物代谢调控研究理论为依据,研究了发酵罐中腺苷生产菌的突变现象。发现该现象与腺苷产生菌的表型(黄嘌呤缺陷型)以及基因型(IMP脱氢酶编码基因guaB)的回复突变有关。进一步从基因的编码序列,基因的稳定期回复突变、基质代谢速率,以及工程尺度的溶氧调控等方面研究其产生的原因及控制策略。发现发酵罐中前期溶氧浓度高,菌体代谢速率加快,主要营养物质如黄嘌呤、鸟苷、氨基酸等供应不足,导致菌体生长受到限制。在发酵过程中添加其缺陷型物质黄嘌呤、并从工程控制尺度,采取发酵前期的限氧策略,调节了菌体的代谢速率,明显改善了产苷状况。