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目的：
近视是最常见的一种屈光不正，近年来近视发病率逐年上升，近视所致的并发症在中国人群中成为第二大致盲因素。近视的发病机制十分复杂，确切病因尚不明确，普遍认为遗传、环境因素均可能起到一定作用。目前认为病理性近视可能主要受遗传因素影响，因此利用遗传学方法寻找病理性近视的致病基因，是近视研究的良好切入点。本课题组在前期工作中使用了全基因组关联分析（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）和全基因组重测序技术来筛选高度近视易感基因，提示N-型和L-型电压依赖性钙离子通道在病理性近视发生中可能具有重要作用；另外采用转录组测序技术（RNAsequencing，RNA-Seq）筛选形觉剥夺性近视（formdeprivationmyopia,FDM）小鼠视网膜中的差异表达基因及信号通路，发现钙离子信号通路明显富集。为了明确钙信号通路是否参与近视的形成，本研究将1）利用流式细胞术检测形觉剥夺近视视网膜钙离子通道是否发生改变，明确钙离子通道异常与近视形成的相关性；2）给予野生型小鼠腹腔注射钙通道激动剂和拮抗剂，观察其对小鼠正常屈光发育和形觉剥夺性近视的影响，以明确钙通道是否参与小鼠的近视形成。
方法：
实验动物选取3周龄野生型C57BL/6J小鼠。在实验开始前对小鼠的屈光及眼部疾病进行初次筛选，将屈光参差、小眼、白内障眼病等的小鼠淘汰。（1）检测近视发生时小鼠钙离子信号通路变化：将所有小鼠随机分成两组，一组作为正常对照组（Normalcontrol，NC），另一组为形觉剥夺组（Formdeprivation，FD），在近视造模两天和四周后通过细胞流式技术检测视网膜内钙离子水平变化。（2）钙离子拮抗剂对正常屈光发育影响：正常小鼠的药物注射实验：①L型钙通道拮抗剂维拉帕米（verapamil）干预实验：将小鼠随机分成正常对照组、溶剂组（生理盐水）、药物低剂量组（1.1mg/kg）和高剂量组（3.3mg/kg）四组，每天一次腹腔注射，实验前、实验两周以及四周后分别通过屈光、眼轴等生物学参数的测量，实验结束后用流式细胞术检测视网膜钙离子水平；②N型钙通道拮抗剂ω-conotoxinGVIA干预实验：将小鼠随机分为对照组、溶剂组（生理盐水）、药物低剂量组（33.3μg/kg）和高剂量组（100μg/kg）。每天一次腹腔注射，实验前、实验两周以及四周后分别进行屈光、眼轴等生物学参数的测量，实验结束后采用流式细胞术检测视网膜钙离子水平。（3）钙通道激动剂和对小鼠形觉剥夺性近视的影响：将已经进行形觉剥夺的小鼠随机分为对照组（单纯形觉剥夺）、溶剂组（0.5%DMSO）和药物组（L型钙通道激动剂BayK86442.8mg/kg）三组。每天一次腹腔注射，在实验前和实验四周后进行屈光和眼轴等参数检测，试验结束后采用流式细胞术检测视网膜钙离子水平。
结果：
1、单纯形觉剥夺实验中，钙流式细胞术结果显示：形觉剥夺2天的小鼠视网膜钙离子水平没有明显变化，剥夺4周钙离子水平没有统计学改变，但T眼和正常对照组相比有下降趋势：NC组钙离子含量最高，剥夺眼（T眼）含量最低，但无统计学差异。
2、正常小鼠钙拮抗剂干预实验：L型钙通道拮抗剂维拉帕米注射两周后低剂量组相对于溶剂组屈光明显向近视方向发展（p=0.0338），给药四周后，低剂量与高剂量组相对于溶剂组屈光均向近视方向发展，但无统计学差异。N型钙通道拮抗剂ω-conotoxinGVIA注射两周和四周后结果中低剂量组和高剂量组屈光均略低于对照组，但无统计学差异。流式细胞术结果与屈光统计结果较为一致。说明L型钙通道拮抗剂对小鼠向近视方向发展有一定的促进作用；N型钙通道拮抗剂对小鼠屈光发育没有明显影响。
3、形觉剥夺小鼠钙激动剂注射实验：L型激动剂组（BayK8644）处理组剥夺眼与对侧眼屈光无明显差异，而对照组和溶剂组剥夺眼相对于对侧眼明显向近视方向发展（对照组p=0.0042；溶剂组p=0.0012）。流式细胞术结果显示激动剂组钙离子含量有高于对照组和溶剂组的趋势，但并没有统计学差异。说明钙通道激动剂可抑制小鼠的屈光向近视方向的发展。
结论：
1、在长期（4周）形觉剥夺过程中，剥夺眼视网膜中钙离子总量有减少趋势，提示钙通道可能参与了近视的形成。
2、L型钙通道激动剂抑制近视发展且拮抗剂促进近视形成的结果，提示视网膜L型钙通道在小鼠屈光发育过程中有一定的影响。
3、N型钙通道拮抗剂对小鼠屈光发育无明显作用，提示视网膜N型钙通道可能在小鼠屈光发育中未起作用。
近视是最常见的一种屈光不正，近年来近视发病率逐年上升，近视所致的并发症在中国人群中成为第二大致盲因素。近视的发病机制十分复杂，确切病因尚不明确，普遍认为遗传、环境因素均可能起到一定作用。目前认为病理性近视可能主要受遗传因素影响，因此利用遗传学方法寻找病理性近视的致病基因，是近视研究的良好切入点。本课题组在前期工作中使用了全基因组关联分析（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）和全基因组重测序技术来筛选高度近视易感基因，提示N-型和L-型电压依赖性钙离子通道在病理性近视发生中可能具有重要作用；另外采用转录组测序技术（RNAsequencing，RNA-Seq）筛选形觉剥夺性近视（formdeprivationmyopia,FDM）小鼠视网膜中的差异表达基因及信号通路，发现钙离子信号通路明显富集。为了明确钙信号通路是否参与近视的形成，本研究将1）利用流式细胞术检测形觉剥夺近视视网膜钙离子通道是否发生改变，明确钙离子通道异常与近视形成的相关性；2）给予野生型小鼠腹腔注射钙通道激动剂和拮抗剂，观察其对小鼠正常屈光发育和形觉剥夺性近视的影响，以明确钙通道是否参与小鼠的近视形成。
方法：
实验动物选取3周龄野生型C57BL/6J小鼠。在实验开始前对小鼠的屈光及眼部疾病进行初次筛选，将屈光参差、小眼、白内障眼病等的小鼠淘汰。（1）检测近视发生时小鼠钙离子信号通路变化：将所有小鼠随机分成两组，一组作为正常对照组（Normalcontrol，NC），另一组为形觉剥夺组（Formdeprivation，FD），在近视造模两天和四周后通过细胞流式技术检测视网膜内钙离子水平变化。（2）钙离子拮抗剂对正常屈光发育影响：正常小鼠的药物注射实验：①L型钙通道拮抗剂维拉帕米（verapamil）干预实验：将小鼠随机分成正常对照组、溶剂组（生理盐水）、药物低剂量组（1.1mg/kg）和高剂量组（3.3mg/kg）四组，每天一次腹腔注射，实验前、实验两周以及四周后分别通过屈光、眼轴等生物学参数的测量，实验结束后用流式细胞术检测视网膜钙离子水平；②N型钙通道拮抗剂ω-conotoxinGVIA干预实验：将小鼠随机分为对照组、溶剂组（生理盐水）、药物低剂量组（33.3μg/kg）和高剂量组（100μg/kg）。每天一次腹腔注射，实验前、实验两周以及四周后分别进行屈光、眼轴等生物学参数的测量，实验结束后采用流式细胞术检测视网膜钙离子水平。（3）钙通道激动剂和对小鼠形觉剥夺性近视的影响：将已经进行形觉剥夺的小鼠随机分为对照组（单纯形觉剥夺）、溶剂组（0.5%DMSO）和药物组（L型钙通道激动剂BayK86442.8mg/kg）三组。每天一次腹腔注射，在实验前和实验四周后进行屈光和眼轴等参数检测，试验结束后采用流式细胞术检测视网膜钙离子水平。
结果：
1、单纯形觉剥夺实验中，钙流式细胞术结果显示：形觉剥夺2天的小鼠视网膜钙离子水平没有明显变化，剥夺4周钙离子水平没有统计学改变，但T眼和正常对照组相比有下降趋势：NC组钙离子含量最高，剥夺眼（T眼）含量最低，但无统计学差异。
2、正常小鼠钙拮抗剂干预实验：L型钙通道拮抗剂维拉帕米注射两周后低剂量组相对于溶剂组屈光明显向近视方向发展（p=0.0338），给药四周后，低剂量与高剂量组相对于溶剂组屈光均向近视方向发展，但无统计学差异。N型钙通道拮抗剂ω-conotoxinGVIA注射两周和四周后结果中低剂量组和高剂量组屈光均略低于对照组，但无统计学差异。流式细胞术结果与屈光统计结果较为一致。说明L型钙通道拮抗剂对小鼠向近视方向发展有一定的促进作用；N型钙通道拮抗剂对小鼠屈光发育没有明显影响。
3、形觉剥夺小鼠钙激动剂注射实验：L型激动剂组（BayK8644）处理组剥夺眼与对侧眼屈光无明显差异，而对照组和溶剂组剥夺眼相对于对侧眼明显向近视方向发展（对照组p=0.0042；溶剂组p=0.0012）。流式细胞术结果显示激动剂组钙离子含量有高于对照组和溶剂组的趋势，但并没有统计学差异。说明钙通道激动剂可抑制小鼠的屈光向近视方向的发展。
结论：
1、在长期（4周）形觉剥夺过程中，剥夺眼视网膜中钙离子总量有减少趋势，提示钙通道可能参与了近视的形成。
2、L型钙通道激动剂抑制近视发展且拮抗剂促进近视形成的结果，提示视网膜L型钙通道在小鼠屈光发育过程中有一定的影响。
3、N型钙通道拮抗剂对小鼠屈光发育无明显作用，提示视网膜N型钙通道可能在小鼠屈光发育中未起作用。