我国最新人口死因调查数据显示,心血管疾病已成为国人健康的最主要“杀手”。心律失常,特别是严重的室性心律失常（室性心动过速、室颤等）造成的“心源性猝死”是心血管疾病致死的直接原因。“老年”是心律失常发生的独立风险因素,当伴发心血管疾病（常见心肌缺血）时严重心律失常的发生率显著升高,构成了心血管疾病死亡的主要人群。然而,对老年人心律失常易感性增加的潜在离子通道机制尚未完全了解。延迟整流K+通道是决定心室动作电位时程（APD）和动作电位形态的关键分子基础,先天性通道基因突变、疾病或药物导致延迟整流K+通道功能异常是心律失常发生的重要原因。心室肌细胞的延迟整流K+通道按照动力学特征可区分为快、慢激活延迟整流成分(对应电流为IKr和IKs),IKr和IKs是人等大型哺乳动物心室动作电位复极2期和3期的主要电流。研究表明,静息状态下心室复极以IKr电流为主,而运动、应激导致交感神经兴奋时情况下通过β肾上腺素受体（βAR）激动增大IKs,动作电位（AP）复极加速,心室复极化转变为以IKs为主。因此,IKs是交感神经兴奋时心脏重要的复极储备。一般认为IKs通道是由KCNQ1编码的孔区亚单位和KCNE1编码的辅助亚单位共同组成。βAR（β1AR或β2AR）激活后通过偶联兴奋性G蛋白（Gs）激活腺苷酸环化酶（AC）、增加环磷酸腺苷（c AMP）,并进一步激活蛋白激酶A（PKA）。PKA可以磷酸化KCNQ1亚基N末端S-27和S-92位点,从而加速通道激活。越来越多的证据表明,Gs-c AMP-PKA通路对IKs的调控障碍是KCNQ1/KCNE1先天性基因突变和获得性离子通道病（如心力衰竭）中心律失常风险增高的重要分子基础。有研究表明,衰老果蝇的心律失常发生率显著升高,而与人KCNQ1同源基因的表达显著减少,提示衰老心脏心律失常易感性增加可能与IKs功能障碍有关。但是,迄今尚无哺乳动物心脏IKs功能随龄变化的证据。已知豚鼠心室动作电位复极K+通道与人相似,即以延迟整流K+电流为主。因此,本研究观察豚鼠心室IKs通道功能随龄改变,阐明衰老心脏心律失常易感性增加的分子基础,预期为老年人群抗心律失常新靶点提供实验依据。第一部分老年豚鼠心脏电生理特征目的:在整体动物和急性分离的心肌细胞水平观察心脏组织学和电生理特征随龄改变情况。方法:1.心脏组织学特征及衰老标志物随龄改变:将豚鼠（雄性）按年龄分为Young组（1-3月龄）和Old组（24月龄以上）。选取左室游离壁组织进行取材,组织病理学检测心肌组织结构及纤维化情况,并测定心脏重量指数。ROS活性氧和β半乳糖苷酶染色试剂盒检测两种衰老生物标志物含量。2.心脏电生理特征随龄改变:（1）体表ECG:异氟烷吸入麻醉进行体表心电图（ECG）记录并分析ECG各参数变化;（2）动作电位频率依赖性:酶消化法急性分离左室游离壁心肌细胞（心内膜）,全细胞电流钳记录动作电位（AP）,并依次进行低（0.5 Hz）、中（1 Hz）、高（2 Hz）频率刺激。采用的电极外液（m M）:KCl 4.0、Na Cl138.0、Ca Cl22.0、Mg Cl21.0、Na H2PO40.33、Glucose 10.0、HEPES 10.0（p H 7.4 with Na OH）;电极内液（m M）:K-glutamate 120.0、KCl 25.0、Mg Cl21.0、Ca Cl21.0、HEPES 10.0（p H 7.2 with KOH）。（3）Langendorff离体心脏ECG:离体心脏灌流梯度浓度选择性βAR激动剂异丙肾上腺素（1μM和3μM）以观察心脏心律失常易感性随龄的改变3.心脏延迟整流钾通道功能随龄改变:（1）延迟整流钾通道编码基因和蛋白表达:提取两组豚鼠心肌左室游离壁组织总RNA和蛋白,应用q RT-PCR技术检测延迟整流钾通道编码基因,主要包括:KCNH2、KCNQ1和KCNE1,以GAPDH作为内参进行定量分析;应用Western-Blot技术检测通道蛋白表达水平,主要包括:Kv11.1、Kv7.1和KCNE1,以α-Tubulin作为内参进行定量分析。（2）延迟整流钾通道电流水平:酶消化法急性分离左室游离壁心肌细胞（心内膜）,全细胞电压钳记录IKs和IKr电流,并测量尾电流幅值。采用的电极外液（m M）:Na Cl 132.0、KCl 4.0、Ca Cl21.8、Mg Cl21.2、Glucose5.0、HEPES 10.0（p H 7.4 with Na OH）;电极内液（m M）:KCl 140.0、Mg Cl21.0、Mg-ATP 4.0、EGTA 5.0、HEPES 10.0（p H 7.2 with KOH）。灌流的细胞外液中加入1μM Nimodipine以阻断L-型Ca2+电流,加入3μM E4031以阻断IKr电流或1μM HMR1556以阻断IKs电流;对同一细胞连续灌流含梯度浓度ISO的细胞外液,观察并测量IKs尾电流幅值改变情况。结果:1.心脏组织学特征随龄的改变及衰老标志物检测:左室心肌组织结构未见显著改变,Old组较Young组心肌纤维化程度增加,ROS活性氧和β半乳糖苷酶含量较高,但心脏重量指数未见明显改变。2.心脏电生理特征随龄改变:（1）体表ECG:体表ECG分析显示Old组豚鼠PR、RR、QTc（心率校正的QT）以及Tp-e间期显著延长,Tp-e/QTc比值显著增大（P＜0.05或P＜0.01）。（2）动作电位频率依赖性:细胞AP记录结果显示,对AP复极达90%的时程（APD90）进行统计分析发现,Young组细胞在1 Hz和2 Hz频率刺激下,分别与0.5 Hz时相比,其APD90呈频率依赖性缩短（1 Hz:416.4±32.31 vs 521.1±34.78 ms,P＜0.01;2 Hz:276.8±18.47 vs 521.1±34.78ms,P＜0.01）,而Old组细胞在1 Hz频率刺激下,与0.5 Hz时相比,其APD90无明显缩短（497.8±31.01 vs 589.2±62.75 ms,P＞0.05）,仅在2Hz高频率刺激下,与0.5 Hz时相比,其APD90显著缩短（350.5±16.34vs 589.2±62.75 ms,P＜0.01）。将0.5 Hz频率下APD90作为基线,分析两组在1 Hz和2 Hz频率刺激时APD90的变化百分率可见,与Young组相比,Old组APD90较基线的百分缩短率明显较低（1 Hz:-8.89±4.89 vs-20.46±3.82%,P＜0.01;2 Hz:-31.67±6.19 vs-45.71±3.71%,P＜0.05）。而组间比较还可以看出,不论在什么频率下,Old组APD90均长于Young组,且在2 Hz频率下有明显的统计学意义（P＜0.05）。（3）Langendorff离体心脏ECG:Langendorff离体心脏灌流梯度浓度ISO后,心脏通常表现为心率加快。对ISO持续灌流20 min后的PVCs的发生数目进行统计发现,在3μM ISO刺激下,Old组较Young组显著增加（8.00±4.93 vs 0.75±0.75个,P＜0.05）。而在1μM ISO刺激下,两组虽无统计学差异,但也可观察到Old组PVCs发生数较多（P＞0.05）。对VT、VT等严重室性心律失常的发生率进行统计可见Young组（12.5%）明显低于Old组（80%）（P＜0.05）。已知QTc间期缩短率可以反映心脏复极储备能力,以ISO灌流前QTc作为基线对两组QTc变化率统计发现,Young组心脏QTc间期呈ISO浓度依赖性缩短,而Old组心脏则无此反应,并且前者的缩短程度在高浓度ISO下明显大于后者（P＜0.05）。3.心脏延迟整流钾通道功能随龄改变:（1）延迟整流钾通道编码基因和蛋白表达:组织q RT-PCR和Western Blot结果显示,通道编码基因和蛋白表达在两组间均无明显差异（P＞0.05）。（2）延迟整流钾通道电流水平:心肌细胞膜片钳结果显示,两组IKs和IKr电流密度在基础水平不存在显著差异（P＞0.05）;而ISO引起青年心室肌细胞IKs在+20 m V至+80 m V电压范围内尾电流密度显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。相反,老年心室肌细胞IKs对ISO表现为浓度依赖性电流密度降低（P＜0.01）。以最大尾电流对各电压下电流进行标准化,并用Boltzmann方程拟合得到激活曲线。可见ISO引起青年组激活曲线向左移动,而老年组则没有。小结:实验表明24月龄豚鼠具备衰老组织特征;老年豚鼠心脏高频电刺激下复极储备减弱;老年豚鼠心脏心律失常易感性升高;与青年心脏不同,老年心脏βAR激动导致IKs电流降低。第二部分老年心脏βAR激动抑制IKs电流的分子机制目的:在豚鼠心肌细胞和异源表达系统上分析βAR激动抑制IKs电流的分子机制。方法:1.全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞IKs电流,测量尾电流幅值。记录方式、使用内外液及ISO急性灌流方式同上。其它药理学阻断剂或激动剂用适当溶剂（三蒸水、DMSO等）配制成母液冷冻保存,使用前用细胞外液稀释至工作液浓度后依次进行灌流。2.在异源表达系统上进一步验证Gi蛋白对IKs电流的调控作用。在稳态转染KCNQ1/KCNE1的HEK293细胞上,瞬时转染β2AR、Gi和GFP质粒,表达24-48小时后进行ISO急性灌流的膜片钳实验,观察IKs电流的变化情况;瞬时转染后孵育Gi蛋白抑制剂PTX过夜,再进行上述相同实验,观察IKs电流的变化情况。结果:1.β2AR-Gi中介IKs抑制性反应:（1）心肌细胞记录结果显示Old组细胞,给予特异性β2AR阻断剂Butoxamine（10μM）后再进行ISO（1μM和3μM）灌流,则ISO对IKs的抑制作用逆转为显著增加,1μM和3μM ISO给药前后+80 m V电压下尾电流密度分别为（2.11±0.13 vs 1.52±0.12 p A/p F,P＜0.01）和（2.45±0.14 vs 1.52±0.12 p A/p F,P＜0.01）,而特异性β1AR阻断剂CGP20712A则对原抑制反应无影响;预先用PTX孵育心肌细胞后再进行ISO灌流,亦呈现抑制作用翻转,+80 m V电压下尾电流密度同样显著增加（1μM:2.04±0.20 vs 1.58±0.20 p A/p F,P＜0.01;3μM:2.57±0.29 vs 1.58±0.20p A/p F,P＜0.01）;提示β2AR-Gi中介IKs抑制性反应。（2）在稳定表达KCNQ1/KCNE1的HEK293细胞瞬转β2AR质粒,IKs记录结果显示,ISO（1μM）引起+50 m V电压下尾电流密度显著增加（50.11±3.04 vs 41.43±2.23 p A/p F,P＜0.01）。而当共表达β2AR和Gi2蛋白后,ISO引起+50 m V电压下尾电流密度显著降低（39.60±3.57 vs 48.81±3.89p A/p F,P＜0.01）;孵育PTX（1.5μg/m L）后再给予相同的ISO,+50 m V电压下尾电流密度逆转为显著增加（47.97±3.80 vs 43.62±3.10 p A/p F,P＜0.01）。上述作用均可以被部分冲洗回来。这些结果进一步证实了β2AR-Gi的作用。2.β2AR-Gi调控IKs下游分子:老年豚鼠心室肌细胞分别孵育Gβγ抑制剂Gallein（100μM）、PLC抑制剂U73122（1μM）或PKC抑制剂Bis-1（100 n M）,均可逆转ISO引起的IKs电流降低（P＜0.01）。小结:老年豚鼠心脏中β2AR-Gi中介ISO对IKs抑制性反应,此反应可能通过Gβγ-PLC-PKC通路降低IKs电流。第三部分β2AR-Gi信号抑制IKs在心律失常发生中的作用目的:青年豚鼠心肌特异性过表达Gi2,验证激活Gi信号对心律失常发生的作用,以及探究分别在老年和过表达Gi蛋白的青年心脏中抑制Gi活性对心律失常发生的保护作用。方法:1.Young组豚鼠脚趾静脉注射腺相关病毒载体r AAV9-Gi2过表达Gi蛋白（r AAV9-EGFP为对照）,感染6周后取心、肝、脾、肺、肾等组织,利用激光共聚焦成像技术验证病毒感染的心肌特异性,q RT-PCR技术验证目的基因过表达效率。感染成功后进行后续实验。2.Langendorff离体心脏灌流梯度浓度ISO（1μM和3μM）以观察过表达Gi蛋白后青年心脏心律失常发生情况;给予PTX预处理后,再分别对老年心脏和过表达Gi蛋白后青年心脏进行相同浓度的ISO灌流,观察心律失常发生情况。3.全细胞膜片钳技术记录心肌细胞IKs电流,测量尾电流幅值。对病毒感染后的细胞连续灌流含梯度浓度ISO的细胞外液,观察并测量IKs尾电流幅值改变情况。结果:1.心脏特异性过表达Gi2验证:腺相关病毒静脉注射6周后,不同组织检测目的蛋白表达情况,结果显示成功在心脏特异性过表达Gi2蛋白。r AAV9-Gi2感染后Gi2基因表达水平比对照组升高约2倍（P＜0.01）。2.干预Gi对心律失常的影响:Langendorff离体心脏灌流梯度浓度ISO后,EGFP组（病毒对照组）心脏表现为心率加快,且未见明显心律失常发生。对药物持续灌流20 min后的PVCs的发生数目进行统计发现,在3μM ISO刺激下,Gi2过表达组较EGFP组显著增加（32.20±8.28 vs0.00±0.00个,P＜0.05）。统计VT、VT等严重室性心律失常的发生率发现,同样Gi2过表达组（80%）明显高于EGFP组（0%）（P＜0.01）。以ISO灌流前QTc作为基线对两组QTc百分变化率分析发现,EGFP组心脏QTc间期呈ISO浓度依赖性缩短,而Gi2过表达组则无此反应;若预先给予PTX再给与上述相同浓度的ISO,可观察到不论是老年心脏还是过表达Gi2蛋白的青年心脏,均表现为心率加快,与预先灌流PTX时相比,两组心脏ISO灌流后QTc均呈浓度依赖性缩短（P＜0.01）,且完全预防ISO诱发的心律失常。3.青年豚鼠心脏过表达Gi2后IKs对ISO的反应性:结果表明,ISO引起了对照组青年豚鼠8/9的心肌细胞IKs增加,相反,在Gi2过表达的心脏中,13/16的心肌细胞出现了抑制性反应。小结:心脏βAR激动下,Gi蛋白过表达可以明显增加室性心律失常易感性,以PTX抑制Gi活性可以降低心律失常发生率。结论:本研究在离体心脏和细胞水平证明,衰老豚鼠心脏βAR激活可引起心脏IKs电流急性降低,此反应由β2AR-Gi信号转导途径介导。βAR激动抑制IKs是衰老心脏心律失常易感性增加的重要机制。该研究结果为临床老年心律失常的预防和治疗策略提供了新的实验基础。