背景与目的:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是临床上较为常见的神经外科急危重症,约占所有卒中的5%,自发性蛛网膜下腔出血患者约80%是由颅内动脉瘤破裂所致,约15%的SAH病人院前死亡。SAH后30天死亡率高达30%～45%。,而幸存者中有一半会遗留下严重的神经功能障碍,显然SAH具有较高的死亡率和致残率,造成极大的社会经济损失[1,2]。因迄今为止SAH引起脑损伤的病理生理机制仍不明确,因此深入研究SAH的病理生理学机制将对我们探寻有效的治疗新靶点提供很大的帮助。SAH最初72小时内的损伤被定义为早期脑损伤(Early brain injury,EBI)[3],近几年来大量临床或动物研究表明EBI是SAH患者急性期死亡和后期神经功能缺损的重要影响因素而其发生及严重程度则与SAH的不良预后密切相关。目前,针对EBI已开展了大量的研究,对其病理发生机制有了初步的认识,主要包括:皮层广泛去极化,凋亡,炎症,氧化应激等。其中,神经元凋亡是主要机制之一[4,5],但神经元凋亡的具体信号通路仍需进一步深入研究。大量的动物实验也显示减轻神经元凋亡能够有效改善SAH引起的神经功能受损。促凋亡和抗凋亡相关蛋白共同参与SAH后细胞凋亡的发生,因此细胞凋亡的病理机制和药物干预的研究显得至关重要。Hippo信号通路在调控细胞凋亡、生长及增殖等功能中扮演了重要的角色。Mammalian STE20-like kinase 1(MST1)广泛表达于多种组织中,是 Hippo 信号通路核心元件,属于丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine)蛋白激酶。MST1在多种疾病中能通过调节多条不同的凋亡通路引起细胞凋亡,但MST1是否参与了SAH后神经元凋亡尚缺乏研究。体内体外实验均证实MST1参与氧化应激引起的神经元凋亡[6,7]。MST1通过诱导促凋亡因子Bim基因表达导致神经元凋亡[8,9]。我们推测:SAH后MST1被激活,进而参与凋亡反应,包括:P53向核内转移,JNK和p38MAPK的磷酸化,caspase-3活化,Bax激活等,引起神经元凋亡。揭示MST1在SAH后神经元凋亡中的作用为SAH的病理机制及其治疗策略提供了新的思路。这是本课题拟阐明的问题之一。但如果以上假说成立,MST1参与SAH后神经元凋亡,那么,MST1的激活又是如何被调控的?研究发现:蛋白L-异天冬氨酰甲基转移酶(Protein-L-isoaspartate(D-aspartate)O-methyltransferase,PCMT1)存在于大多数生物和细胞中,在脑内和睾内大量表达,尤其是脑内室旁和视上核,黑质和蓝斑的神经元细胞[10]。研究发现CGP 3466B增加PCMT1的表达,进而抑制缺氧诱导的MST1激活,缓解心肌细胞凋亡[11]。体外实验还发现CGP 3466B能发挥抑制神经元凋亡的作用[12],治疗帕金森氏病。另一个体内实验证实:连续服用CGP3466B能够缓解氧化应激反应引起的大鼠多巴胺能神经元的变性[13]。但目前尚未发现研究探讨过PCMT1和CGP 3466B在SAH后脑损伤中的作用。本课题推测:SAH后大量ROS产生引起PCMT1表达下降,从而磷酸化激活MST1,引发SAH后神经元凋亡。CGP3466B可以激活PCMT1,缓解SAH后神经元凋亡,从而为我们切断MST1上游信号通路提供了新想法。这是本项目拟阐明的另一个问题。本课题拟通过体内实验结合从多个水平验证两个假设:(1)SAH激活MST1,引发下游多条凋亡通路的激活导致神经元凋亡。阻断MST1激活能够缓解SAH后神经元凋亡;(2)SAH激活MST1有赖于PCMT1的减少,增加PCMT1能够抑制MST1的活性,从而缓解SAH后神经元凋亡,阐明PCMT1/MST1信号通路调控SAH后神经元凋亡及其相关机制,为临床治疗SAH后EBI提供新策略。材料与方法:本研究总共使用了 117只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,重量在300-320g间,采用颈内动脉内线栓穿刺法建立蛛网膜下腔出血大鼠模型。SAH模型成立后1小时将外源性PCMT1激动剂CGP 3466B给予腹腔注射。模型成立后24小时开始实施SAH出血量评分,Garcia神经功能评分,脑水含量测定。采用免疫荧光法检测神经元凋亡。采用Western blotting印迹分析内源性PCMT1,MST1,phospho-mst1(p-mst1)),裂解MST1(cl-MST1),等凋亡相关蛋白的表达情况。应用免疫荧光共染技术检测PCMT1和MST1是否在SAH大鼠脑内神经元细胞内表达。本课题的内容还有在SAH模型的大鼠成功建立后,为阐明PCMT1的作用机制而进行的实验,PCMT1抑制MST1的激活的情况及其具体机制。前期研究证明白屈菜赤碱(Chelerythrine)可以增加cl-MST1的含量,促进细胞凋亡,而花萼海绵诱癌素A(CalycalinA)则是激活全长MST1分子内激酶区域的磷酸化,增强MST1的促凋亡活性,上述两种药物代表了 MST1激活的两种不同机制。我们将把上述两种药在建模后分别注入大鼠蛛网膜下腔出血的大鼠的侧脑室中并与单独给予外源性PCMT1(CGP3466B)做比较。最后采用Western blotting检测Mst1、p-Mst1-Thr183、cl-caspase3、Bcl-2、Bax 等相关蛋白水平表达量的变化。结果:外源性CGP3466B改善了大鼠的神经功能降低了脑水肿,抑制了 MST1激发的神经元凋亡。双重免疫荧光证明了 PCMT1和MST1在神经元胞质里的表达,成立后24小时,免疫荧光证明外源性CGP 3466B通过抑制caspase-3通路进而降低了神经元的凋亡。Western blotting的结果表明外源性CGP 3466B提高了 PCMT1的表达,降低了 caspase-3的表达。结论:内源性PCMT1通过降低MST1磷酸化和cl-MST1的水平抑制了神经元凋亡。PCMT1/MST1通路可能是治疗SAH减轻早期脑损伤的新靶点。