前言：环境砷污染是一个严重的公共卫生问题,长期饮水砷暴露可对儿童智力发育产生不利影响,导致儿童的行为异常和智力障碍,砷暴露也可引起实验动物学习记忆能力下降,然而砷损伤学习记忆能力的机制目前尚不清楚。　　 星形胶质细胞(astrocyte,AST)是当前神经生物学研究的热点,目前认为,脑高级神经活动不是由神经元网络单独完成的,而是由相互作用的神经元-胶质细胞网络实现的。电镜观察发现,海马等脑区的突触被AST的突起紧紧包绕,并与突触前、后膜共同形成突触的三联体结构。最新研究结果显示,AST膜也存在谷氨酸(glutamate,Glu)受体,它能与突触前膜释放的Glu结合,导致AST内钙离子浓度(intracellular free Ca2+ concentration,[Ca2+]i)的升高,产生一系列的生化反应,进而促使AST分泌Glu、D-丝氨酸等胶质细胞源性递质,这些胶质细胞源性递质反作用于突触前、后膜上的相应受体,调节突触的可塑性。因此,如果AST的上述功能受到外来化学物质的干扰而发生任何的紊乱,将严重影响突触可塑性的调控。另一方面,脑组织的超微结构显示,AST位于神经元和毛细血管内皮细胞之间,故AST在血管和神经元之间形成了一个屏障,这提示血液中外来化学物质透过血管内皮细胞后,应首先进入AST,故AST应是砷进入脑组织后,首先蓄积并损伤的细胞。　　 本研究以砷对神经元-胶质细胞网络的影响为研究主线,以原代培养的AST和神经元为研究对象,通过在神经元培养体系中加入星形胶质细胞条件培养液(astrocytes conditioned medium,ACM),探讨砷通过影响胶质细胞源性递质的分泌,进而干扰神经元内信号转导过程及突触的形成,为确立AST中砷对突触可塑性的影响及揭示砷智力损伤机制提供实验参考数据。　　 方法：　　 1、砷对AST的一般毒性作用进行AST的原代培养,通过胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色判定培养细胞的种类和纯度,纯度在95％以上进行细胞毒理试验研究。形成单层的AST在0、2.5、5、10、20或30μmol/L的含砷培养液中培养24 h,染毒结束后,通过倒置相差显微镜观察细胞形态学改变,采用MTT比色法检测细胞活力、荧光双波长分光光度法测定[Ca2+]i。　　 2、砷对Glu诱导的胶质细胞源性递质分泌的影响AST在0、2.5、5或10μmol/L,的含砷培养液中培养24 h后,更换成含25、50或100μmol/L Glu的细胞外液进行诱导。激光共聚焦扫描显微镜法实时检测细胞内Ca2+荧光强度:按上述方法染砷结束后,更换成含25μmol/L Glu的细胞外液分别诱导10、20或30 min后,更换成不含Glu的细胞外液,在培养箱中孵育6 h后,收集细胞外液,采用高效液相色谱法检测细胞外液中Glu、D-丝氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸和牛磺酸的含量。　　 3、AST内砷对神经元突触形成和信号转导的影响分别进行神经元及AST的原代培养,采用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和GFAP免疫荧光染色方法对培养细胞的种类和纯度进行鉴定,纯度在95％以上的进行下一步的试验研究。AST在0、5或10μmol/L的含砷培养液中培养24 h后,更换成含25μmol/L,Glu的细胞外液诱导10 min,除去细胞外液,换成不含血清的DMEM培养液,培养6 h,收集细胞培养液,即为ACM。将原代培养的神经元随机分为4组,纯培养组、0μmol/L砷处理ACM组、5μmol/L砷处理ACM组和10μmol/L砷处理ACM组,培养3 d后,通过倒置相差显微镜观察神经元形态、免疫荧光法测定神经元内突触素含量、透射电镜法观察突触形成。分别在含ACM培养液中培养4、8或12 h后,收集神经元,采用Western blot法检测神经元内NR1、NR2A、NR2B、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependentprotein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)和诱导型一氧化氮合酶(induced nitricoxide synthase,iNOS)蛋白的表达。　　 4、统计分析　　 实验数据采用SPSS13.0进行统计分析。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用q检验(SNK)。以P＜0.05作为差异有统计学意义的判定标准。　　 结果：　　 1、砷对AST的一般毒性作用细胞形态观察结果显示,20μmol/L砷暴露后,少量细胞开始脱壁,细胞呈圆形;随砷暴露浓度的增加,脱壁细胞数量明显增多,细胞间隙增大;30μmol/L砷暴露组细胞变大,突起变短或消失。细胞活力检测结果显示,与对照组相比,5μmol/L砷暴露可引起AST细胞活力显著下降,在5-30μmol/L砷暴露范围内,随砷暴露浓度的增加,细胞活力均显著下降;细胞内[Ca2+]I检测结果显示,与对照组相比,10μmol/L砷暴露可引起AST内[Ca2+]i显著升高,在10-30μmol/L砷暴露范围内,随着砷暴露浓度的增加,AST内[Ca2+]i均显著升高。　　 2、砷对Glu诱导的胶质细胞源性递质分泌的影响不同浓度砷暴露后,Glu诱导的AST内[Ca2+]i均升高,与对照组相比,5和10μmol/L砷暴露组的AST内[Ca2+]i显著升高;静息状态下,与对照组相比,不同浓度砷暴露AST分泌的D-丝氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸水平显著增加,而Glu和牛磺酸水平无明显变化;Glu诱导后,与对照组相比,不同浓度砷暴露AST分泌的D-丝氨酸、甘氨酸、γ氨基丁酸和牛磺酸水平均显著升高,10μmol/L砷暴露AST分泌的Glu水平显著升高,与2.5和5μmol/L砷暴露组相比,10μmol/L砷暴露AST分泌的D-丝氨酸水平也显著升高。　　 3、AST内砷对神经元突触形成和信号转导的影响不同浓度砷处理的ACM培养3 d后的神经元细胞5-10个聚集成团,周围突起清晰,均匀细长,突起之间相互交织成网。与纯培养组比较,无砷处理ACM组的神经元集落间突起丰富,网络稠密;与无砷处理ACM组比较,5和10μmol/L砷处理ACM组的神经元突起连接相对稀疏,以10μmol/L砷处理ACM组的神经元表现较明显;突触素荧光标记物呈红色颗粒状,沿神经元胞体和突起排列,可清晰勾勒出神经元胞体和突起的轮廓,有的呈串珠状,在胞体部分有些可融合成块状,与纯培养组比较,无砷处理ACM组的神经元上突触素标记的荧光颗粒数明显增多;与无砷处理ACM组比较,5和10μmol/L砷处理ACM组的神经元上荧光颗粒数明显减少,以10μmol/L砷处理ACM组的神经元改变最明显;无砷处理ACM组神经元上突触素荧光颗粒物数量显著高于纯培养组;5和10μmol/L砷处理ACM组神经元上突触素荧光颗粒物数量显著低于无砷处理ACM组,10μmol/L砷处理ACM组显著低于5μmol/L砷处理ACM组;透射电镜观察结果显示,与纯培养组比较,无砷处理ACM组突触数量明显增多,与无砷处理ACM组比较,5和10μmol/L砷处理ACM组突触数量明显减少;Western blot法检测分析结果显示,与纯培养组相比,无砷处理ACM组神经元内NR1蛋白表达无显著差异,与无砷处理ACM组相比,5和10μmol/L砷处理ACM培养不同时间后的神经元内NR1蛋白表达也无显著差异;与纯培养组相比,无砷处理ACM组的神经元内NR2A蛋白表达无显著差异,与无砷处理ACM组相比,10μmol/L砷处理ACM培养8 h的神经元内NR2A蛋白表达显著降低,而5μmol/L砷处理ACM培养不同时间及10μmol/L砷处理ACM培养4或12 h的神经元内NR2A蛋白表达无显著差异;与纯培养组相比,无砷处理ACM组神经元内NR2B蛋白表达无显著差异,与无砷处理ACM组相比,5和10μmol/L砷处理ACM培养12 h的神经元内NR2B蛋白表达显著降低,而4或8 h神经元内NR2B蛋白表达无显著差异;与纯培养组相比,无砷处理ACM培养8 h的神经元内CaMKⅡ蛋白表达显著升高,而4或12 h的神经元内CaMKⅡ蛋白表达无显著差异;与无砷处理ACM组相比,10μmol/L砷处理ACM培养8 h的神经元内CaMKⅡ蛋白表达显著降低,而5μmol/L砷处理ACM培养不同时间及10μmol/L砷处理ACM培养4或12 h的神经元内CaMKⅡ蛋白表达无显著差异;与纯培养组相比,无砷处理ACM培养4h的神经元内AC蛋白表达显著升高,而8或12 h的神经元内AC蛋白表达无显著差异;与无砷处理ACM组相比,5和10μmol/L砷处理ACM培养4 h的神经元内AC蛋白表达显著降低,而8或12 h的神经元内AC蛋白表达无显著差异;与纯培养组相比,无砷处理ACM培养4、8或12 h的神经元内iNOS蛋白表达均无显著差异,与无砷处理ACM组相比,5和10μmol/L砷处理ACM培养4、8或12 h的神经元内iNOS蛋白表达也无明显变化。　　 结论：　　 1、5μmol/L砷暴露可对AST产生明显的毒性损伤作用,且在5-30μmol/L剂量范围内,具有剂量-效应关系。　　 2、10μmol/L砷暴露引起AST内钙超载,且在10-30μmol/L剂量范围内具有剂量-效应关系。　　 3、砷暴露可使Glu诱导的AST内[Ca2+]i显著升高,干扰AST内Ca2+信号的产生。　　 4、砷暴露可对Glu诱导的胶质细胞源性递质分泌产生影响,进而可能对突触的形成和神经元内信号转导产生不利影响。　　 5、砷对AST的损伤可间接抑制原代培养神经元间突触的形成。　　 6、砷对AST的损伤间接抑制了神经元内NMDA受体亚单位蛋白表达,进而影响NMDA受体的功能。　　 7、神经元内Ca2+/CaM-CaMKⅡ-GluR和AC-cAMP-PKA信号转导通路可能参与了AST对神经元的调控机制。　　 8、砷对AST的损伤间接抑制了神经元内CaMKⅡ和AC蛋白表达,进而可能对神经元内Ca2+/CaM-CaMKⅡ-GluR和AC-cAMP-PKA信号转导通路产生不利影响。