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大青叶蝉(Cicadella viridis)又名浮尘子、大绿浮尘子、小绿叶蝉、青叶蝉、青叶跳蝉,是一类重要的农业和林果业害虫,是危害最大范围最广的害虫之一,也是很多植物病原菌的重要传播媒介。治理好大青叶蝉,是农业和林果业获得丰收的重要措施之一。研究不同生境的大青叶蝉肠道细菌多样性,可以为探讨其肠道细菌对大青叶蝉的生理功能和生态学意义奠定基础,为进一步了解大青叶蝉与其共生菌的协同进化、物种进化途径提供新的认知,通过检测大青叶蝉体内的共生微生物有望开辟出防治大青叶蝉的新方法。江苏南京和浙江永康两地,不仅在地理位置有相对距离,在生态气候等方面也有较大的差异。本研究通过采集南京和永康二地的大青叶蝉,应用PCR-DGGE技术通过克隆测序分析大青叶蝉肠道细菌的16S rRNA基因序列,比对研究了不同生境下(不同季节、不同地理分布和不同宿主)的大青叶蝉自然种群的肠道细菌多样性。并分别利用植原体(phytoplasma)、螺原体(spiroplasma)、沃尔巴克次氏体(wolbachia)三种细菌的特异性引物对所提大青叶蝉体内细菌总DNA进行PCR扩增,检测在大青叶蝉体内这三类细菌的存在情况。研究结果如下:第一,对相同宿主(狗尾巴草),相同季节(春季),不同地理位置(江苏南京和浙江永康)的健壮大青叶蝉自然种群的肠道细菌多样性进行分析,从中得到大于19种不同的细菌克隆型,其中在永康叶蝉样品中共得到14种不同的细菌克隆型,南京叶蝉样品中共得到11种不同的细菌克隆型,两地菌群种类相似度约为1/3-1/2。通过克隆测序,发现它们的优势菌群主要来自于以下4个不同的细菌纲,分别是α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和芽孢菌纲(Bacilli),永康叶蝉样品中的最优势菌群属于芽孢菌纲(Bacilli),而南京叶蝉样品中的最优势菌群属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),说明地理位置是影响野生大青叶蝉肠道自然菌群的重要因素之一第二,对相同季节(秋季),相同地理位置(浙江永康),不同宿主(桃、李等果树、单季水稻、狗尾巴草)的健壮大青叶蝉自然种群的肠道细菌多样性进行分析,从中共得到12个较清晰的不同细菌克隆型,分别归入4个细菌纲,分别是黄杆菌纲(Flavobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和一个未知纲。采集三种不同植物宿主狗尾巴草、桃、李等果树、单季水稻上的大青叶蝉进行分析,两组重复实验结果均显示在这三种植物宿主上的大青叶蝉肠道菌群无显著差异,即在本研究条件下,相同季节一定的地域范围内宿主植物对于大青叶蝉肠道细菌群落的影响不显著。第三,对相同地理位置(浙江永康),相同宿主(狗尾巴草),不同季节(春季与秋季)的健壮大青叶蝉自然种群的肠道细菌多样性进行分析发现,永康地区4月底5月初,大青叶蝉的最优势菌群属于芽孢菌纲(Bacilli)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),而7月底8月初,大青叶蝉的最优势菌群属于黄杆菌纲(Flavobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),可见相同的地点,相同宿主,不同季节的大青叶蝉肠道自然菌群存在较大差异,说明不同的季节是影响大青叶蝉肠道正常菌群的重要因素之一。第四,螺原体、植原体和沃尔巴克次氏体是昆虫中常见的特殊细菌类群,分别利用特异性引物对采自患有枣疯病枣树周围的正常大青叶蝉进行分子检测,结果只检测到了植原体,没有发现螺原体和沃尔巴克次氏体。植原体目前尚不能人工培养,一般不会感染动物,能在大青叶蝉中检测到植原体,说明大青叶蝉可能也是植原体的传播介体。昆虫肠道为细菌生长的最适宜环境之一,其中存在着大量的细菌,多数为昆虫生长发育所不可或缺的,与昆虫生长发育息息相关。本研究通过PCR-DGGE结合TA克隆测序,初步发现正常大青叶蝉体肠道内存在有α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、芽孢菌纲(Bacilli)和黄杆菌纲(Flavobacteria)以及一个未知菌纲,其中γ-变形菌纲在本研究中采集自不同地点不同时期不同宿主的大青叶蝉样品中均有发现,且都为较优势菌群。本研究结果初步表明不同生境(包括不同季节和不同地理位置等)是影响大青叶蝉肠道微生态的重要因素,而相同环境内的不同宿主对大青叶蝉肠道细菌的影响并不显著。