柑橘胶孢炭疽菌毒素的粗提取及致病性研究

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炭疽病是严重影响柑橘采后贮藏的重要病害,半知菌亚门炭疽菌属的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)为柑橘炭疽病的主要致病菌,有较强的致病能力,能引起贮藏期间的柑橘产生病斑甚至腐烂,造成严重的经济损失。目前国内对柑橘炭疽病的研究主要集中于病原菌的生长特性及其拮抗菌筛选等方面,对于胶孢炭疽菌毒素致病性的报道较少。国外有关胶孢炭疽菌毒力大小的研究指出环境p H、病原菌的分泌蛋白和编码与致病力有关的基因是病原菌的毒力因子,改变p H等条件会影响病原菌的致病力。然而,这些报道主要集中在毒素的产生条件、结构分析和是否具有寄主专化性等。本试验研究了胶孢炭疽菌的最佳产毒培养基以探究最适产毒因子;毒素的粗提取以及粗毒素对柑橘显微结构以及生理代谢的影响以探究毒素的致病性;对羟基苯甲酸对采后柑橘的抗性诱导以探究柑橘贮藏的新方式等。主要研究结果如下:1、体外培养胶孢炭疽菌,通过改变培养基的类型和成分来研究最佳产毒培养基。研究表明:不同类型的培养基中察氏培养基产生的毒素能在柑橘上形成较大病斑;改变察氏培养基中碳源、氮源和无机盐的种类可以影响毒素的生成,最佳的碳源为果糖,氮源为硝酸钠,无机盐为磷酸氢二钾;通过四因素四水平正交实验研究产毒的最适培养条件,分别为温度30℃,时间19天,转速100 r/min,p H为8。在此条件下产生的病斑直径为5.39±0.22 mm。2、在最适产毒培养基的基础上,通过比较硫酸铵分级沉淀法和不同极性有机溶剂浸提法来研究胶孢炭疽菌毒素的粗提取,得出甲醇浸提后得到的上清液能产生最大的病斑。经基本化学本质分析得出粗毒素含有的主要成分为酮糖、蛋白或氨基酸等极性物质。高温和改变p H值均会影响粗毒素的活性。3、将得到的粗毒素配制成不同的浓度以研究粗毒素对柑橘果皮显微结构的影响,得出随着粗毒素浓度的增加以及培养时间的延长,粗毒素对柑橘果实细胞造成的伤害也越大,果皮细胞呈现出皱缩和破裂的形态。其原因可能是粗毒素中含有能够水解细胞壁的相关酶类以及某些致病成分。4、研究粗毒素对柑橘生理代谢的影响可知:胶孢炭疽菌粗毒素能使柑橘果实产生典型的病斑症状,且使丙二醛含量显著增高,细胞壁成分含量降低。当毒素浓度较低时,果实病斑直径与多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、类黄酮以及木质素含量呈正相关;与纤维素、半纤维素和果胶含量呈负相关。毒素浓度增高时,果实机体及防御酶系统遭到破坏,酶活急剧下降。胶孢炭疽菌粗毒素能影响柑橘果实生理代谢,引起果实发病,最终导致病斑的形成。由此证明毒素在胶孢炭疽菌对柑橘的致病过程中起到重要作用。5、对羟基苯甲酸能够诱导采后柑橘果实的抗性,延长柑橘保质期。试验中可知对羟基苯甲酸对采后柑橘炭疽病病原菌有较强的抑菌活性,浓度越高,对病原菌的抑制作用越强。经对羟基苯甲酸处理的柑橘果实中,抗性相关酶活性升高,丙二醛含量下降。并且对羟基苯甲酸诱导的抗性相关酶在整个试验过程中维持较高的活性。对羟基苯甲酸处理对采后柑橘炭疽病病原菌有较强的抗菌作用,能提高柑橘果实相关抗性酶活性以及抑制膜脂过氧化反应,诱导其果实抗性。对柑橘采后贮藏保鲜具有重要意义。
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