背景动脉粥样硬化(AS)是冠心病、脑梗死等心脑血管疾病的共同发病基础。WHO 2009年卫生统计年鉴资料表明2004年我国心血管疾病的死亡率为279/10万人,明显高于肿瘤死亡率143/10万人。加强对AS机制的探索以及防治AS有效药物的开发有着重要的现实意义。AS形成的病理生理机制虽然尚未完全明确,但目前比较公认的是炎症反应学说：AS是多种细胞对“入侵”动脉壁的“病原性”脂蛋白进行的炎症反应。在众多参与AS过程的病理因素中,关键性步骤是单核细胞迁移入内膜下,受局部氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的刺激被激活分化为巨噬细胞,无限制地吞噬ox-LDL,从而转化为泡沫细胞形成最早的AS病变脂质条纹。此外,作为标志性病理特征,巨噬泡沫细胞同样参与了AS的各个过程：它可分泌多种炎症因子以及基质金属蛋白酶(MMPs),加速AS进展,甚至引起急性冠脉综合征。因此,抑制巨噬泡沫细胞被认为是防治冠心病,尤其是早期预防AS的重要靶标之一。巨噬细胞对脂质的摄取主要通过其表面的清道夫受体(SR)介导,其中SR-A、D36和LOX-1对ox-LDL的摄取可达90%。LOX-1是1997年Savamura等在牛主动脉内皮细胞上发现的一种C型植物血凝集素样氧化低密度脂蛋白受体,它可特异性地结合ox-LDL。生理条件下,它在主动脉内膜微量表达；但在病理状态下体内ox-LDL浓度升高时则过量表达,并诱导单核巨噬细胞转化为泡沫细胞。多项研究证实,LOX-1还可介导ox-LDL致斑块中VCAM-1、MCP-1、TNFα、IL-1等因子及MMPs表达增加的过程,从而对AS进展发挥重要作用。鉴于ox-LDL被巨噬细胞吞噬造成内皮细胞损伤是AS的关键启动因素,所以,其特异性受体LOX-1可能是抗AS药物作用的一个重要靶点。有效阻断LOX-1与ox-LDL的结合,可能可以从源头上阻断ox-LDL对血管的损伤,起到防治AS的作用。番石榴叶为桃金娘科植物番石榴Psidium guajava L的干燥叶及带叶嫩茎,分布于广东、广西、四川等地,主要化学成分有黄酮、鞣质、挥发油、有机酸等。中医理论认为其性平,味甘涩,入脾、胃、大肠、肝经,具有止渴、止血、止泻等功用。现代药理研究表明,番石榴叶具有抗炎、降血糖以及降血脂等作用。体内外实验表明它对于AS防治也具有一定疗效,然而其作用的具体机制仍未十分清楚。其中黄酮类化合物是其发挥生物活性的重要成分之一。黄酮广泛存在于食物和植物药中,具有多方面的生物学功效。从上世纪八十年代开始,黄酮类化合物在治疗冠心病、AS方面的作用逐渐受到关注。天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能通过血脑屏障,对于治疗心脑血管疾病具有独特的优势。国内外不少学者对不同种类的黄酮进行研究,证实许多天然黄酮类化合物能有效治疗冠心病、减轻AS。因此,我们认为番石榴叶抗AS的作用很可能与其含有的黄酮类化合物成分有关。在本实验中,我们以THP-1(人急性单核细胞性白血病细胞)巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察番石榴叶总黄酮(Total flavonoids from Psidium guajava leaves)对泡沫细胞形成的影响,并尝试从LOX-1途径入手,探讨其抗AS的可能的作用机制,为番石榴叶的进一步广泛应用提供科学依据。目的以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察番石榴叶总黄酮抑制泡沫细胞形成的作用及其相关机制,为番石榴叶的进一步广泛应用提供科学依据。方法1、THP-1细胞的培养从液氮罐中取出冻存细胞株,迅速投入37℃水浴中充分摇动,使其快速融化(1min左右)。细胞加入4倍体积的完全培养基(含10%FBS的RPMI 1640)中,低速离心(500r/min,5min)后去上清液,重新加入完全培养基,置于37℃, 5%CO2培养箱中培养。细胞密度控制在106个/mL,每两天换液一次,每四天传代一次。采用直接传代法,细胞悬液以800r/min速度离心5min,弃去上清液的1/2-2/3,然后用吸管直接吹打沉靠在瓶壁的悬浮细胞,形成悬液后加新培养液混匀传代。细胞复苏后,传至3-5代后用于建模。2、THP-1细胞的分化将佛波酯(PMA)加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,稀释PMA至终浓度为100ng/mL,然后将细胞接种于6孔板培养48h。3、巨噬泡沫细胞模型的建立及鉴定在已分化为巨噬细胞的6孔板中,加入无血清RPMI 1640培养液及ox-LDL,使ox-LDL终浓度为50μg/mL,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。油红O染色观察细胞浆内是否有脂质沉积,判断巨噬细胞是否已转化为泡沫细胞。ox-LDL作用24小时后,用D-Hanks液洗涤细胞3次,4%多聚甲醛固定10min, 60%乙醇浸泡1min,油红O染色15min,水洗5min,苏木素染色5min,蒸馏水漂洗返蓝10min。显微镜下观察其形态特点并拍摄照片。4、CCK-8法测定不同浓度番石榴叶总黄酮对细胞活性的影响用含PMA和10%FBS的RPMI 1640培养液配成THP-1单个细胞悬液,按每孔5000～10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200μL。37℃、5%CO2培养箱中培养48小时后THP-1贴壁分化为巨噬细胞。用无血清的RPMI 1640培养液按梯度配制不同浓度的番石榴叶总黄酮(15μg/mL,30μg/mL,60μg/mL, 120μg/mL,250μg/mL,500μg/mL),加入巨噬细胞中,每组设3个复孔,每孔100μL,培养24小时。每孔加入10μL CCK-8溶液,继续孵育4小时。用多标记微孔检测仪在450nm波长下测定吸光度。重复3次。5、实验分组取诱导分化后的巨噬细胞,根据建模及药物干预需要按如下设计随机分组：1)对照组：无血清培养液培养；2) ox-LDL组：无血清培养液中加入ox-LDL,使终浓度为50μg/L；3)番石榴叶总黄酮干预组：在ox-LDL组基础上加入番石榴叶总黄酮。根据CCK-8结果,在其安全范围内选取三个浓度分别作为低、中、高三个剂量组。5组细胞在37℃、5%CO2培养箱中静置培养24h后进行各项检测。6、细胞总蛋白提取用NP-40裂解液裂解上述各组细胞,静置15min,吸取各孔液体,10000～15000g离心3～5min。取上清移至新离心管,-80℃保存。用BCA法测定蛋白含量。以牛血清白蛋白(BSA0.5mg/mL)为标准品作标准曲线,测定各组总蛋白浓度,以mg/mL表示。操作按试剂说明书进行。重复4次。7、酶偶联比色法检测泡沫细胞内胆固醇含量用胆固醇标准品(517mmol/L)作胆固醇标准曲线。各待测样品与测定总胆固醇试剂按1：20的比例充分混匀,置37℃水浴反应10min。采用多标记微孔检测仪,以空白管校零,在545nm波长下比色读取各管吸光度值。根据吸光度值做出标准曲线,计算样品总胆固醇含量,测定各组胆固醇浓度,以μmol/g蛋白为单位。8、Western blot法检测巨噬泡沫细胞LOX-1的蛋白表达在各组蛋白样品中加入上样缓冲液,10%SDS-PAGE电泳,转膜,脱脂奶粉封闭90min,加入一抗4℃孵育过夜,1×TBS液洗涤3次,10min/次,加入二抗,37℃孵育,1×TBS液洗涤3次,10min/次。ECL化学发光试剂盒显色,Kodak全光谱多功能活体成像系统曝光。Image tool V3.0图像分析软件读取条带灰度值。实验重复4次。9、统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析,所有数据均采用均数±标准差(x±S)表示,各组均数比较使用one-way ANOVA。方差齐时,组间比较用Bonferroni;方差不齐时用Welch稳健估计,再用T3方法两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1、巨噬泡沫细胞的形态学特点单核细胞株THP-1复苏后,镜下观察为球形悬浮生长细胞,一般为单个细胞分散分布,少数聚集成团。细胞边缘光滑折光性好。THP-1经PMA诱导48小时后,由悬浮生长变成贴壁生长,由圆形变成不规则形态,呈梭形、星形,胞膜周围有突出,细胞体积进一步增大,细胞浆疏松,内含较多颗粒。在抗胰蛋白酶消化能力试验中,可见贴壁细胞经0.25%胰蛋白酶消化后15～20min后变圆,但用吸管反复吹打仍不脱落,证明THP-1已转化为巨噬细胞。分化后的巨噬细胞加入50μg/mL ox-LDL作用24h后,经固定和油红O染色,显微镜下见细胞体积增大,细胞浆内红染颗粒状脂质空泡较明显增多,提示细胞内脂质成分增加,说明泡沫细胞基本形成。2、CCK-8法测定不同浓度番石榴叶总黄酮对巨噬细胞活性的影响CCK-8结果显示,番石榴叶总黄酮浓度过高时对巨噬细胞的活性有一定影响。500μg/mL组作用24小时后细胞活力较对照组下降31.97%,差异具有统计学意义(P<0.05),提示该浓度的番石榴叶总黄酮具有一定毒副作用。而虽然250μg/mL组的细胞活力与对照组比较的差异没有统计学意义,但也呈下降的趋势。因此,本实验选取20、40、80μg/mL三个浓度进行实验,以排除药物自身对细胞的毒性作用。3、番石榴叶总黄酮对巨噬细胞内总胆固醇含量的影响巨噬细胞内总胆固醇含量测定结果显示,经ox-LDL处理24h后,巨噬细胞内总胆固醇含量显著升高(P<0.05),说明巨噬细胞被ox-LDL诱导形成泡沫细胞。三个药物组的总胆固醇含量均低于ox-LDL组(P<0.05),并且总胆固醇含量随番石榴叶总黄酮浓度升高而下降,差异具有统计学意义(P<0.05),提示番石榴叶总黄酮降低胆固醇含量的作用在一定范围内具有量效关系。4、番石榴叶总黄酮对巨噬泡沫细胞LOX-1蛋白表达的影响Western blot结果显示,ox-LDL组细胞LOX-1蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05)。番石榴叶总黄酮三个剂量组的LOX-1蛋白表达均低于ox-LDL组,差异有统计学意义(P<0.05),说明番石榴叶总黄酮可抑制ox-LDL诱导的LOX-1表达。同时,番石榴叶总黄酮不同剂量组的LOX-1蛋白表达水平随剂量升高而降低,各组之间差异有统计学意义(P<0.05),提示番石榴叶总黄酮抑制LOX-1表达在一定范围内具有量效关系。结论番石榴叶总黄酮通过抑制LOX-1的表达,减少巨噬细胞摄取ox-LDL,抑制泡沫细胞形成,从而起到抗AS的作用。