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组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases,HDACs)可以通过去除组蛋白或蛋白质赖氨酸残基上带负电的乙酰基官能团,导致组蛋白与带负电的DNA之间静电作用力增强,染色质致密卷曲,从而起到抑制抑癌基因表达,导致肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡。而组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylase Inhibitor,HDACi)可以通过抑制组蛋白发生去乙酰化,使染色质结构变的松散,更有利于转录因子等蛋白与DNA的结合,起到调控抑癌基因表达的作用。同时HDACi还可以调控一些非组蛋白的乙酰化水平,并通过影响其蛋白的稳定性来影响其所调控的基因表达。目前已有大量研究表明,HDACs与多种肿瘤的发生、发展、治疗以及预后密切相关,并且已有5种HDACi药物已被批准用于临床治疗,但是这些药物不同程度存在一些副作用,如血小板减少、肠胃不适及心律失常等。因此,寻找新的、更有效的HDACi类药物分子一直是抗肿瘤药物研发的一个重要方向。此外,这些已上市的HDACi药物的作用机制还未完全阐明,这也严重阻碍新型HDACi药物的研究进展。本文以HDACs为靶点,通过计算机辅助药物分子筛选方法筛选新型HDACi化合物,并针对筛选到的活性分子进行抗肿瘤作用机制研究。主要工作如下:1.新型HDACi的筛选进一步完善实验室之前研发的虚拟筛选流程,通过SYBYL药效团筛选和GOLD分子对接筛选对ZINC数据库进行筛选,并用SYBYL-X 2.0软件中的Selector模块对筛选到的小分子进行结构多样性聚类,最终得到25个结构差异较大的化合物。随后采用AMBER18对HDAC8与25个化合物及阳性对照SAHA进行2ns分子动力学模拟,并选取最后1 ns的结果进行结合自由能的计算。根据计算机筛选结果,选取了13个化合物进行生物学实验验证。体外酶活性验证了其中3个(ZINC24469384、ZINC48302525和ZINC08671161)可以显著抑制HDAC活性。尤其是苯甲酰胺类ZINC24469384可以在对正常细胞(L02)无毒剂量下对肝癌细胞(HepG2、Hep3B)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(A2780)、胃癌细胞(SGC-7901)活力产生抑制作用,且对肝癌细胞的抑制作用最明显。流式细胞术的结果表明ZINC24469384处理肝癌细胞后凋亡细胞的百分比明显增加,且G1/S期细胞所占比例明显升高。Western Blot结果显示,促凋亡蛋白Bax的表达明显上升,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下降,且细胞周期相关蛋白CyclinA和CyclinB的表达明显受到抑制。以上的结果说明我们通过一系列的筛选获得了一个可以特异性抑制肝癌细胞活力的苯甲酰胺类化合物ZINC24469384。2.ZINC24469384抗肿瘤作用的分子机制研究为了进一步阐明ZINC24469384发挥抗肿瘤作用的分子机制,我们首先通过二代测序的方法检测了ZINC24469384处理4h、16h和24h后HepG2细胞内基因表达及基因可变剪接的变化,进一步分析了差异表达基因及差异选择性剪接基因所属的信号通路,结果显示,ZINC24469384可引起FXR/RXR通路、JAK/STAT、p53信号通路及细胞凋亡通路中基因表达发生改变,同时还可以引起p53信号通路、细胞周期通路中的基因发生可变剪接。说明差异表达基因和差异选择性剪接基因可以分别或共同参与一些信号通路,进而促成ZINC24469384的抗肿瘤作用。另外,ZINC24469384还可以诱导FXR/RXR通路中肝脏特异性表达基因NR1H4的持续高表达,进而诱导JAK/STAT通路的抑制因子SOCS2高表达,抑制STAT3的磷酸化。该结果也通过实时定量PCR和Western-blot实验得到证实。以上结果提示,NR1H4/SOCS2的激活可能是ZINC24469384特异性抑制肝癌细胞活力的机制之一。为了进一步验证我们的结论,我们分析了NR1H4/SOCS2的激活对ZINC24469384特异性抑制肝癌细胞活力的必要性。Western blot以及流式细胞术分析结果发现,当我们在HepG2细胞中干涉NR1H4的表达后,ZINC24469384对SOCS2的诱导表达、对STAT3的磷酸化、对细胞周期的阻滞及对细胞的凋亡的激活均受到抑制。所以NR1H4的激活对于ZINC24469384诱导的特异性抑制HepG2细胞的活力,是一个必要条件。同时TCGA数据库中肝癌(LIHC)及胆管癌(CHOL)的mRNA表达数据及临床分期数据表明,随着肿瘤的恶性程度的增加NR1H4与SOCS2的表达呈下调的趋势,表明NR1H4和SOCS2可能在肿瘤发生中起抑制作用,而ZINC24469384可能会逆转肝癌中NR1H4及SOCS2表达下降的现象。综上所述,我们发现了一种新型的苯甲酰胺类HDACi的前体化合物ZINC24469384,其可能通过激活NR1H4的表达起到特异性抑制肝癌细胞活力的作用。本研究为HDACi化合物的设计提供了新的骨架结构为药物设计拓宽了新的领域,也为HDACi的抗肿瘤机制提供了新的方向与理论基础。