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戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一种单股正链无包膜的RNA病毒,基因组长约7.2kb,含有三个相互重叠的开放读码框架(opening reading frame,ORF),其中ORF2编码一个含有保护性中和抗原表位的病毒衣壳蛋白,大小为660个氨基酸,具有高保守及高免疫原性,是目前疫苗研制的主要靶抗原。HEV引起的戊型肝炎(Hepatitis E,HE)呈全球性分布,主要累及发展中国家。HE主要通过粪-口途径传播,临床表现与其他急性病毒性肝炎相似,但是在孕妇中常发生爆发性肝功能衰竭,死亡率高达25%。
目前HE尚无特异性防治手段,良好的饮水卫生设施虽可有效地预防疾病的暴发流行,但在许多地区因经济原因尚无法实施,所以应用疫苗是控制疾病的根本手段,世界卫生组织已将HE疫苗列为21世纪优先发展的疫苗之一。然而,由于HEV缺乏成熟的细胞培养系统,难以制备传统的灭活疫苗和减毒活疫苗,因此,目前只能通过基因工程技术发展基因工程蛋白疫苗或核酸疫苗。
我们在前期研究中将HEV的中和抗原表位定位于HEV ORF2编码蛋白C端的452-617aa之间,并确定为构象依赖型表位。通过原核表达系统,可溶性表达了含有HEV中和抗原表位的重组蛋白P179(ORF2编码蛋白C端的439-617aa)。P179蛋白可在小鼠体内诱导HEV特异性中和抗体,并在非人灵长类动物的攻毒实验中证明其具有保护性。因此,HEV重组蛋白P179可作为HEV候选疫苗的研究。
在HEV DNA疫苗方面,我们将含有HEV中和抗原表位的基因片段p179与美国食品药品管理署(Food and Drug Admirustration,FDA)批准可用于人体的真核表达载体pVAX1进行重组,构建了真核表达质粒pVAX-179,免疫小鼠后发现pVAX-179质粒可成功诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。
本研究利用上述HEV重组蛋白P179以及重组质粒pVAX-179制备出HE蛋白-核酸复合疫苗,通过肌肉免疫Balb/c小鼠,ELISA法检测血清中抗HEV IgG抗体及其各亚类抗体、小鼠脾细胞分泌的IFN-γ和IL-4细胞因子,观察复合疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答是否优于单价蛋白或单价核酸疫苗,并将此作为新型复合疫苗的一个研究模型,拟为研发更多安全有效的复合疫苗提供科学依据。
方法:
分别制备HEV重组蛋白P179及重组质粒pVAX-179,再将两者混合制备成HE蛋白-核酸复合疫苗。以Balb/c小鼠为研究对象,采取大腿肌肉注射的免疫途径和于0、4、8周接种3次的免疫程序。具体分组为:(1)复合疫苗组与单价疫苗对照组:蛋白-核酸复合疫苗组[(1μgP179+100μg pVAX-179)/剂]、蛋白对照组(1μg P179/剂)和核酸对照组(100μg pVAX-179/剂);(2)复合疫苗不同剂量组:低剂量组[(0.5μg P179+50μg pVAX-179)/剂]、中剂量组[(1μgP179+100μg pVAX-179)/剂]和高剂量组[(2μg P179+200μg pVAX-179)/剂]。小鼠免疫后,定期采集血清标本,用ELISA法检测各组小鼠血清中抗HEV-IgG抗体及其亚类抗体;末次免疫后2周取小鼠脾细胞,体外经特异性抗原P179蛋白刺激72h后,以ELISA法分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ及IL-4细胞因子水平。
结果:
1.复合疫苗组与单价疫苗对照组诱导的免疫应答水平比较:蛋白-核酸复合疫苗组小鼠血清中抗HEV-IgG抗体水平高于蛋白对照组(P>0.05)和核酸对照组(P<0.01);蛋白-核酸复合疫苗组的IgG1水平与蛋白对照组的差异无统计学意义(P>0.05),而IgG2a的水平显著高于蛋白对照组(P<0.01);蛋白-核酸复合疫苗组的IgG1与IgG2a的水平均显著高于核酸对照组(P<0.01);蛋白-核酸复合疫苗组的IgG1与IgG2a的比值介于蛋白对照组和核酸对照组二者之间。蛋白-核酸复合疫苗组脾细胞分泌的IFN-γ及IL-4的水平均显著高于蛋白对照组及核酸对照组。结果显示复合疫苗能够诱导机体产生特异性抗-HEV抗体,其水平高于单价疫苗对照组,且复合疫苗大大增强了TH1方向的细胞免疫应答水平,有利于机体的抗病毒免疫。
2.复合疫苗不同剂量组诱导的免疫应答水平比较:低剂量组、中剂量组、高剂量组3组的IgG抗体及IFN-γ、IL-4水平依次升高,IgG1/IgG2a则依次降低,高剂量组的IgG、IgG2a均高于中剂量组(P<0.05),高剂量组的IgG、IgG1、IgG2a均显著高于低剂量组(P<0.01),中剂量组的IgG、IgG1、IgG2a高于低剂量组但差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示复合疫苗能够诱导机体产生特异性抗-HEV抗体,其抗体应答强度随剂量的增加呈上升趋势。随着免疫剂量的增加,复合疫苗逐步增强了TH1方向的细胞免疫应答水平,且呈现一定的量效关系。
结论:
1.与蛋白单价疫苗或核酸单价疫苗相比,蛋白-核酸复合疫苗共免疫可诱导小鼠产生更强的体液免疫应答,并显著增强细胞免疫应答水平,有利于机体的抗病毒免疫。
2.在所研究的蛋白.核酸复合疫苗3个不同剂量范围内,随着免疫剂量的增加,体液免疫应答和细胞免疫应答的水平均有不同程度的升高,呈现一定的量效关系。