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大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)众多血清型中的一个主要菌型,在世界各地包括中国都有过不同规模的暴发流行。由于其强烈的致病性与致死性等特点,给农牧业生产造成巨大的损失,对人们的健康构成巨大威胁,已经成为全球性的公共卫生问题,许多国家已把它列为有重大影响的病原微生物之一。目前对O157的治疗主要采用抗菌药物,但其耐药性问题已相当严重。本实验欲检测临床分离的动物源性大肠杆菌O157耐药株与β-内酰胺类和氨基糖苷类药物耐药机制相关的基因,并对部分相关基因进行克隆、测序,测定其mRNA和蛋白的表达水平,寻找相关基因的变化及表达水平与大肠杆菌O157耐药强度的相关性,为探明O157耐药相关机制奠定基础。 一、动物源性大肠杆菌O157耐药株的分离与鉴定 临床分离来自不同动物的动物源性大肠杆菌O157,经微生物学检验、生化反应和PCR鉴定后,采用药敏纸片法对分离到的29株O157进行了20种抗菌药物的耐药性检测。结果表明:50%以上的分离株对一种或一种以上药物耐药。采用肉汤二倍稀释法测定了耐药株对6种β-内酰胺类抗菌药物和5种氨基糖苷类药物的最低抑菌浓度。其中部分菌株表现出较高的耐药性。 二、临床分离大肠杆菌O157耐药株与β-内酰胺类、氨基糖苷类药物耐药相关基因的检测及克隆与序列分析 根据Genbank中大肠杆菌的blaAmpG blaTEM-121,aphA,aac(6′)-Ib,aac(3)-Ⅳ,aph(2′)-Ib,aadA及大肠杆菌O157:H7 EDL933的pbpA,ompF,ompC,rpsL,rrsA基因序列,设计扩增引物。以临床分离耐药株基因组DNA和质粒DNA为模板进行PCR扩增,将扩增到的目的基因片段连接到pGEM-T-Easy载体上。转入大肠杆菌DH5 α中,利用α互补法筛选阳性克隆,测序。结果,从临床分离