基于不同品种花椒麻味素含量差异的RNA-seq转录组分析

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花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)为芸香科花椒属植物,是我国重要的经济作物之一。花椒麻味素是以羟基-α-山椒素为代表的一系列长链不饱和酰胺类化合物,是花椒麻味的主要来源,但其性质极不稳定,且目前对引起不同花椒品种间麻味差异的机理尚未明确报道。因此,为解析不同花椒品种麻味差异来源,本研究对花椒麻味素进行分离纯化和结构鉴定;分析不同花椒品种麻味素含量的动态差异,构建麻味素HPLC指纹图谱;对麻味素含量差异显著的花椒品种进行RNA-seq分析,鉴定出与麻味素合成相关的关键差异表达基因。主要结论如下:1.从凤县大红袍花椒中分离获得1个花椒麻味素,采用~1H-NMR和13C-NMR技术鉴定其结构为羟基-α-山椒素。以羟基-α-山椒素为标准品,建立了其HPLC定性定量分析方法,并对该方法的精密性、重复性、加样回收率及稳定性进行了考察。2.测定了不同品种花椒果皮羟基-α-山椒素的含量并分析了其差异性。不同品种花椒羟基-α-山椒素含量差异显著(p<0.05),油花椒含量最高(46.936±1.122 mg/g),府谷花椒含量最低(2.235±0.077 mg/g)。构建了12个品种花椒果皮麻味素HPLC指纹图谱,并结合化学计量学进行了综合分析。共标定出12个共有峰,样品间相似度在0.424–1之间。12个品种花椒被聚为4类:G1包含S3(凤县大红袍),S5(韩城大红袍),S7(茂县大红袍),S8(秦安1号)和S10(武都大红袍);G2包括S1(韩城党村无刺),S4(韩城仡佬无刺),S6(韩城无刺),S9(韩城狮子头)和S11(西农无刺花椒);S12(油花椒)和S2(府谷花椒)分别归属于G3和G4。通过主成分分析及判别分析,发现所有归属于G2的样品品质较高,并建立了针对未知样品的预测模型,筛选出花椒质量评价及控制的特征峰为峰9(羟基-α-山椒素)和峰11(未知化合物)。3.揭示了羟基-α-山椒素在不同品种花椒果皮和叶的合成积累动态规律,整体上呈现先迅速增加后缓慢减少的趋势。其中,S1、S4、S7、S9和S10的花椒果皮在7月含量最高;S3、S5、S6、S8、S11和S12在8月含量最高。除S3,S4和S12以外,其余9个品种的花椒叶羟基-α-山椒素含量均在5月至6月间达到最高值。4.通过Illumina Hiseq 2500测序平台,对麻味素含量差异明显的3个花椒品种(韩城无刺,凤县大红袍,府谷花椒)进行了RNA-seq测序。经合并组装后共获得83522条Unigene,有40668条(48.69%)Unigene获得了注释结果,共有123条Unigene与麻味素的生物合成有关。经差异表达分析共获得6656条差异表达基因,根据功能注释结果,共鉴定出了10个不饱和脂肪酸生物合成差异基因及9个缬氨酸、亮氨酸生物合成差异基因。结合结合差异基因在不同品种花椒的表达量及样品间的差异表达倍数,进一步筛选出了6个可能引起花椒麻味素差异性的关键基因(c100784.graph_c0、c102796.graph_c0、c99494.graph_c0、c106250.graph_c0、c95767.graph_c0、c99298.graph_c0),它们主要负责脂肪酸的去饱和以及支链氨基酸的氨基转移两项功能。q RT-PCR结果表明除c102796.graph_c0外,其余5个基因的相对表达量与转录组分析结果相一致,表明转录组测序结果是准确可靠的。
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