研究背景：针灸作为中医有效而神秘的独特疗法,用来治疗各种疾病已有几千年的历史,因其操作方便,成本低廉而疗效确切,已成为世界应用最为广泛的替代医学之一。自古至今,已经有许多方法被用来研究针灸的作用机制。然而,其作用机制尚未完全阐明。这极大地影响了针灸在世界范围的进一步推广和应用。近几十年来,成像技术的应用例如正电子发射断层扫描(Positron Emission Computed Tomography, PET)和功能性磁共振成像(functional magnetic resonance imaging, fMRI),为探索针灸治疗的机制和大脑内在连接的可视化提供了实用的方法,这对针灸机理的研究是至关重要的。鉴于以往影像学技术在针灸临床研究中的成功应用,经络和穴位的特异性研究已经成为一个重要话题,其特异性的部分机理已被大量研究所证实。然而,针灸刺激的特异性仍然需要进一步阐明。经穴效应特异性是指机体对适当刺激经穴所产生的相应反应,相对于刺激非穴或其它经穴所引起的反应所具有的特异性。近年来,国内外学者运用各种方法对经穴效应等问题进行了大量的的研究,虽然研究广泛和深入,但就经穴是否存在效应特异性仍然存在争议。现代医学研究表明,经穴与脑特定皮层功能有密切相关,经穴与靶器官之间发生效应的关键枢纽是人脑,针刺经穴作为一种刺激必须经过人脑进行中枢调节和整合,然后作用于靶器官,从而产生治疗效应。fMRI为针灸经穴的特异性、疗效和作用机理研究提供了新技术。常用的fMRI实验设计方法包括任务态和静息态两种。其中静息态fMRI由于设计简单,基线容易控制,可研究持续的神经活动,优于任务态设计。静息态是指被试者保持清醒、不接受任何外部刺激或执行任何高级功能的状态,与任务态相比,消除了研究中被试对象在执行任务的不同对研究结果产生的影响。在静息态功能磁共振成像研究中,可通过选择不同的分析方法获得大量脑功能连接的信息。主要有两种方法广泛应用于描述局部的特性,即“低频波动的振幅”(Amplitude of low-frequence flucruation, ALFF)和“局部一致性”(Regional homogeneity, ReHo)。两者皆可揭示某些脑区的大脑活动变化。ReHo分析法反映局部功能区时间序列的一致性,为针刺穴位的中枢作用机理研究提供了新方法。基于ReHo的优越性,此方法已应用于研究阿尔茨海默氏症、帕金森病、偏头痛,注意缺陷／多动障碍、轻度认知障碍(Mild cognitive impairment, MCI)和其他疾病。利用ReHo进行针灸研究已经成为国际针灸研究的趋势。因此,我们在研究中以健康志愿者作为研究对象,应用ReHo作为分析工具,能够识别针刺学位引起脑区活动的局部一致性差异。根据中医基础理论及针灸理论,穴位是针灸的重要组成部分,在人体表面的穴位则是疾病的反应点。穴位与特定脏腑、经络、脑神关系密切。从理论上讲,穴位作为一个切入点。因此,许多研究都选择穴位如太冲穴、外关穴、足三里和阳陵泉,运用FMRI观察针刺穴位的脑效应。基于以往的研究,可以明显看出,相对于配穴,单穴位的选择更多的强调特定穴。然而,在中医基础理论中,特别是独特的配穴,很可能会产生特殊的效果。在大多数研究中,穴位成对或成组的选取,往往与相应的疾病有关,即使功能或实证性的临床运用不完全符合中医理论。如《灵枢》载“经气汇聚至合穴”,就充分描述了这种情况。这表明合穴的配穴将更清楚地说明针灸治疗的作用。为证实针刺配穴比针刺单穴更有效,我们选择了足三里(ST36)和阳陵泉(GB34),分别为阳明胃经及阳胆经合穴。此外,一些研究表明足三里配阳陵泉在某些疾病中具有疗效。虽然ST36与GB34所属经络不同,但它们皆属于L5支配的皮肤区域,这意味着它们拥有相同的神经支配和组织学结构。这些穴位是否具有一些特殊的连接,这需要对大脑活动和临床实践中足三里和阳陵泉穴的多重影响进行进一步研究,以期为临床实践中配穴的应用提供依据。针刺治病的作用机理可能类似反射弧,经针刺,传入,中枢效应,传出,效应等环节,其中中枢效应可能关键环节,能更充分阐明其作用机理。我们利用FMRI验证假说：针刺穴位能引起大脑特定区域的脑活动,即针刺穴位具有特异性；针刺刺激组穴将产生几个脑区的激活或失活,且与单穴相比,它会激活或失活单穴无法影响的其他功能区。本研究的设计基于ReHo方法,在健康志愿者中,通过静息态FMRI比较观察针刺足三里、阳陵泉与两穴配伍的脑局部一致性差异,以期阐明针刺足三里、阳陵泉的中枢作用效应,为穴位配伍治病临床应用提供依据。研究目的：1.观察针刺足三里的静息态脑区功能局部一致性(Regional Homogeneity, ReHo),探讨针刺足三里穴的中枢作用机制。2.观察针刺阳陵泉的静息态脑区功能局部一致性(Regional Homogeneity, ReHo),探讨针刺阳陵泉穴的中枢作用机制。3.观察针刺足三里、阳陵泉与两穴配伍的静息态脑区功能局部一致性(Regional Homogeneity, ReHo)差异,为临床实践中穴位配伍治病提供依据。材料与方法：1.研究对象：选择健康成年人10例,其中男性志愿者4例,女性志愿者6例；年龄20～34岁,中位年龄23岁。受试者身体健康,近3个月内未做过针刺,未服用过药物,无任何磁共振检查禁忌症,对实验知情同意并签名。2.针灸器材、扫描设备和地点：针灸针为苏州天协针灸器械有限公司生产的0.32mm×40mm的一次性使用无菌针；扫描设备采用通用电气公司Signa HDxt 3.0T MR扫描仪；实验地点在(省略)3.实验方案：设计与数据采集：3.1针刺方法：由同一位针灸科高年资医师进行所有被试的针刺,而且均针刺被试左侧穴位,针刺的穴位为足三里和阳陵泉。操作过程：针刺被试得气后留针15分钟,并每隔2分钟进行捻针约10秒钟。针刺设计及静息态脑功能成像扫描：采集控制组(针刺前组)、足三里组、阳陵泉组和两穴配伍组的静息态FMRI数据,以及2D和3D解剖像数据。MR数据采集：扫描线圈采用正交头颈线圈。让被试志愿者提前到达MR室熟悉实验环境。被试者保持静息状态,即被试清醒的仰卧在MR扫描床上,保持平静呼吸,并且不进行主动思维活动。为了降低噪音,用橡皮耳塞塞住被试外耳孔,并用泡沫头垫将被试头部固定。具体扫描序列和步骤：(1)扫描序列采用快速自旋回波(FSE),行轴位T1WI液体衰减翻转恢复(T1 FLAIR)扫描,获得结构定位图。总共扫描28层,扫描范围覆盖全脑结构,扫描基线平行于AC-PC,即胼胝体前后联合线；(2)BOLD扫描：扫描序列采用平面回波(EPI),定位像以T1WI FLAIR序列为准,扫描层数同结构定位图,总共图像为8400幅；(3)三维结构图：扫描序列采用高分辨率三维成像序列,脑容积成像(Brain volumeimaging,BRAVO)进行全脑结构图像采集,获得136幅高分辨率的三维结构MR图。4. fMRI数据处理与统计：4.1数据预处理：将原始图导入工作站,采用(SPM8, statistical parametric mapping)统计参数图软件包(该软件包在MATLAB2009b上运行,http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/免费获取)和DPARSF软件包(该软件包基于SPM8和REST1.2软件)。用MRIcro软件(http://www.mricro.com)把所获得的图像数据转换成nifti格式。运用统计参数软件SPM8对输入的图像数据进行空间预处理。步骤如下：①剔除部分图像,前10个时点的图需剔除,因为磁场到达稳态的时间和被试者对环境的适应可能影响结果；②时间校正：可减少每幅图在获取时间上的不同；③头动校正：头动三维平移>lmm,三维旋转>1。的被试数据必须剔除,通过头动校正以减少头动噪声对信号的影响：④空间标准化：利用MNI模板(由加拿大蒙特利尔神经科学研究所提出)将所有被试者的功能图像序列空间标准化,对激活的脑功能区进行空间定位；⑤空间平滑：对所有标准化后的数据进行高斯平滑,即与一个半高全宽值(FWHM, full width half maximum)为8毫米的各向同性的高斯核进行卷积处理,提高图像的信噪比;⑥低频滤波：应用0.01-0.08Hz频段对所获得的信号进行低频滤波,将高频和更低频信号的干扰予以去除。然后对所获得的低频波信号进行ReHo分析。4.2 ReHo分析：ReHo分析采用REST软件(Resting state FMRI data analysis toolkit,http: //sourceforge. Net/projects/resting-fMRI),该软件由北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室开发完成。通过REST软件计算出脑内每个体素与其周围相邻体素在时间序列上的一致性,得出该体素的肯德尔和谐系数(Kendall’s coefficient of concordance, KCC),即为该体素的ReHo值。每个体素均有一个ReHo值,构成了被试者的ReHo脑。一个给定点的肯德尔和谐系数KCC的计算公式如下：其中W就是给定点的肯德尔和谐系数KCC,它的取值范围在0-1之间；n是时间点数,本研究中n=250;K是给定体素点与其邻域体素点的总数,本研究中K=27,即给定点本身及其26个邻域点,这27个体素点又称为一个簇(cluster);Ri是第i个时间点的27个体素点的体素值的等级总数；R是Ri的平均值。4.3图像查看：将上述后处理后得到的具有统计学意义的脑区叠加到标准脑图像中,获得表达解剖信息和统计信息的叠加图,并包含矢状位、冠状位、横轴位或3D图像等多种图像模式的信息,运用Slice Viewer及Xjview等看图插件读出各激活脑区在MNI模板上的坐标、解剖位置及T值等信息。5.统计学方法：采用SPM8软件,将针刺配伍组、足三里组、阳陵泉组与对照组标准化ReHo脑图进行两样本配对t检验,取两组单样本t检验结果的并集作为mask,在此范围内对结果进行FDR校正,p<0.05,T=2.262,K>405,去除小于10体素值无意义的区域,得出针刺配伍组、足三里组、阳陵泉组针刺前后的静息状态下大脑ReHo的统计差异。以及配伍组与足三里组、阳陵泉组之间的ReHo差异。结果：1.针刺足三里组与针刺前组(对照组)之间的ReHo差异具有统计学意义ReHo值增高的脑区：右侧前扣带回,左侧额中回；ReHo值减低的脑区：左侧小脑半球,右侧后扣带回,左侧豆状核,右侧岛叶皮层,左侧胼胝体,左侧楔前叶,右侧额叶内侧回。2.针刺阳陵泉组与针刺前(对照组)之间的ReHo差异具有统计学意义ReHo值增高的脑区：前扣带回、左侧颞上回、右侧顶下小叶、右侧额中回；ReHo值减低的脑区：左侧丘脑、右侧岛叶皮层、左侧额下回、右侧前扣带回。3.配穴组和针刺前(对照组)之间的ReHo差异ReHo值增高的脑区：左侧内囊,右侧额叶白质,左侧额叶白质和右侧扣带回；ReHo值减低的脑区：右侧小脑后叶,左侧中央前回、左侧楔前叶和右侧额下回。4.配穴组和ST36组之间的ReHo差异ReHo值增高的脑区：左顶叶小叶(BA40)和右额叶皮质(BA6)；ReHo值减低的脑区：左枕叶皮层(BA19)和左额下回(BA9)。5.配穴组和GB34组之间的ReHo差异ReHo值增高的脑区：右侧小脑后叶,前扣带回(BA32),左侧额中回(BA46),左侧楔前叶(BA7)、右侧额中回(BA9)和右侧顶下小叶(BA40)；ReHo值减低的脑区：左侧岛叶皮质(BA13)和左侧脑白质。结论：1.针刺足三里穴引起了大脑、小脑、胼胝体、边缘系统等多个脑区的ReHo值发生改变,提示针刺足三里的脑效应是一个复杂的过程,可能是多个脑区通过脑网络综合发挥作用。2.针刺阳陵泉后引起了包括认知、运动、默认网络、边缘系统等多脑区的局部一致性(ReHo)改变,提示针刺阳陵泉的脑效应区与其功效有一定对应关系,其中枢作用机制可能是各级脑功能网络综合作用。3.针刺足三里、阳陵泉配穴相对于针刺单穴可激活更广泛的脑区,此外针刺配穴可激活一些新的脑区及产生新的疗效。