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油菜是世界重要油料作物之一,是我国重要的食用油来源。我国消费的食用油40%以上靠油菜籽提供。我国是油菜种植大国,种植面积和总产量均居世界第一。每年我国种植油菜在1亿亩左右,产油菜籽1400万吨左右,含油率40%左右,提供食用油500万吨左右。每年我国食用油消费的缺口在1100万吨以上,提高我国油菜品种的含油率,是目前解决我国食用油短缺的当务之急。我国油菜籽含油率低于加拿大、澳大利亚、欧盟等,油菜籽进口主要从加拿大和澳大利亚。近年来,生物技术发展迅猛,特别是转基因技术、基因干扰表达技术(RNAi),对作物资源创新、品种选育、基因表达研究等提供了先进的技术支持,降低品种选育周期,降低成本、提高了效率。日本学者首先发现大豆、油菜籽中油脂储存与蛋白质成负相关关系,我国学者陈锦清利用这一原理,提出了油菜籽中蛋白质与油脂积累的“底物竞争假说”。根据这一假说,丙酮酸是蛋白质和脂肪酸合成的共同底物,通过竞争丙酮酸完成蛋白质和油质的积累。在油菜种子发育过程中,光合作用所产生的糖类物质,经过糖酵解作用产生丙酮酸(PEP),丙酮酸经过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的作用生成草酰乙酸,进入蛋白质代谢途径。丙酮酸经过丙酮酸脱氢酶系(乙酰辅酶A羧化酶)催化生成乙酰CoA,乙酰CoA是合成脂肪酸的前体物质,最终进入脂肪酸合成代谢途径。由此,抑制蛋白质的合成在一定程度上就能提高油质的积累。丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化进入蛋白质代谢途径的,因此,抑制PEPC基因的表达,就可能抑制蛋白质积累,最终提高油质的含量。本研究应用RNAi干扰表达技术,从甘蓝型油菜中克隆PEPC酶活性位点序列,构建ihpRNA遗传表达载体。通过转基因技术将遗传表达载体转化进入受体植株,并对转化后代进行鉴定,并分析转化后代植株PEPC基因表达量的变化以及转基因后代植株的蛋白质、含油率、脂肪酸成分的变化。本研究从PEPC基因克隆、载体构建、遗传转化、基因表达、脂肪酸成分分析,全面详细的研究PEPC基因抑制后对油菜含油率、蛋白质、脂肪酸成分的变化的影响,为RNA干扰技术以及PEPC基因应用研究奠定了理论基础。其主要研究结果包括：1.通过NCBI检索甘蓝型油菜PEPC基因全序列(D13987),Blast比对PEPC基因的保守序列,发现PEPC基因全序列6603bp,共有9个外显子,8个内含子和一个polyA的信号尾巴,位于第4号外显子内的2637-2859序列保守性最强。利用PROSITE数据库对PEPC基因的功能区域进行预测,发现PEPC基因存在2个酶活性位点,第一个酶活性位点正是第4号外显子保守序列编码区域。对不同油菜种进行PCR扩增,所克隆的PEPC基因保守序列比较发现,该保守序列高度一致,从甘蓝型油菜F008中克隆的序列与NCBI公布序列完全一致,白菜型油菜与芥菜型油菜,该序列同源性达96%以上。同时,利用PCR扩增油菜种子储存蛋白启动子Napin,比对该启动子序列发现功能调控元件都存在,与NCBI公布序列相似度达98%,启动基因转录功能正常。2.利用从甘蓝型油菜中所克隆的启动子以及PEPC基因保守序列(酶活性位点序列)构建了RNA干扰表达载体pCAMNapin-B 1-NEI-B2,以及pBI35S-B1-NEI-B2表达载体。在载体构建过程中,测序发现重组质粒在大肠杆菌的复制过程中回文序列容易被剪切,而且剪切是随机的。通过反复连接,克隆实验,最终获得了一个与实验预期一致的ihpRNA载体结构,对该载体序列进行甲基化测序发现,该载体中存在2个甲基化位点,甲基化作用保护载体序列在大肠杆菌中的复制过程被剪切。分析发现甲基化位点处于中间载体部分,目标片断序列未出现甲基化,因此,该载体仍能在受体细胞中起到正常转录双链RNA.的作用。3.通过农杆菌介导的Floral-dip和子叶、下胚轴遗传转化方法,将质粒表达载体转入甘蓝型油菜F008、Westar受体材料中,并对转化后代植株进行了抗性筛选、PCR特异扩增,PCR-Southern,以及DNA测序分析鉴定。通过对Floral-dip转化方法与子叶、下胚轴转化方法的比较,发现Floral-dip转化方法效率较高,平均转化效率达到了0.69%,受基因型影响较小,转化过程简单、操作性强、无需组织培养；但抗性筛选过程繁琐；子叶、下胚轴转化效率较低分别是0.25%,0.15%,受基因型影响较大,操作过程复杂,周期较长。4.用野生型植株与转化植株进行荧光定量PCR比较分析,发现转化植株PEPC基因存在不同程度的表达抑制现象,开花后10天,F008材料的平均抑制率达58.82%,平均抑制效果为61.5%; Westar材料表达抑制率达到了83.33%,平均抑制效果为50%。开花后25天,F008材料PEPC基因的平均表达抑制率23.53%,平均抑制效果为29.75%；Westar材料PEPC基因的平均表达抑制率达到了33.33%,平均抑制效果为58.5%。对T2代植株进行了PCR扩增和甲基化检测,分析发现,F008材料T2代植株共扩增材料187株,阳性植株128株,阳性率68.50%；Westar材料T2代共扩增植株144株,阳性植株93株,阳性率64.58%,阳性植株约占扩增植株的2/3,符合一对基因的孟德尔遗传规律,并对T2代植株进行基因组Southern blot分析,发现转化植株都为单拷贝插入。转化植株与野生型植株进行了PEPC基因甲基化检测,发现转化植株的甲基化率明显提高,从增加2个位点到增加5个位点不等,说明RNA干扰在一定程度上对目的基因DNA存在甲基化调控表达的作用,这可能与RNA抑制目的基因表达的调节机制有关。5.转化植株与野生型植株进行了蛋白质、含油率及脂肪酸成分分析,发现T1代转基因植株,F008材料含油量平均提高2.41个百分点,相对提高5.97%,蛋白质平均降低3.39个百分点,相对降低10.85%；Westar材料含油量平均提高1.51个百分点,相对提高3.72%；蛋白质平均降低3.42个百分点,相对降低10.73%。T2代转基因植株,F008材料含油量平均提高2.42个百分点,相对提高5.18%,蛋白质平均降低2.23个百分点,相对降低8.35%；Westar材料含油量平均增加2.1个百分点,相对提高5.16%,蛋白质平均降低1.34百分点,相对降低4.81%。同时,转基因后代在脂肪酸成分上存在变化,T2代转基因植株中,F008材料平均油酸含量比野生型植株高4.30个百分点,最高提高了10.19个百分点,亚油酸平均降低了2.89个百分点,亚麻酸平均降低了1.20个百分点；Westar材料油酸平均增加了2.15个百分点,最高提高了5.87个百分点,亚油酸降低了2.04个百分点,亚麻酸降低了0.11个百分点。