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目的:本课题旨在构建含有四环素调控人Numb基因过表达调控组份的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒载体,以及构建含有四环素调控人Numb基因过表达反应组份的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒载体,并测定它们的滴度,为Numb调控人干细胞“干性”的研究提供实验基础。方法:1、采用酶切技术将Lenti-egfp-IRES-puro载体酶切后获得Lenti-IRES-puro骨架。采用凝胶电泳技术验证rtta基因片段。将rtta基因片段连接到Lenti-IRES-puro骨架上得到Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增,提取质粒通过酶切及基因测序验证后,将Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞,分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞,48小时后,通过ELISA方法测定其滴度。2、使用酶切技术将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4载体酶切后获得Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架。使用RT-PCR技术从人胚胎干细胞总RNA中获得人Numb基因片段,将人Numb基因片段连接到Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架上得到Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增,提取质粒通过酶切及基因测序验证后,将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞,分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞,48小时后,通过DAPI细胞染色方法测定其滴度。结果:1、Lenti-egfp-IRES-puro载体经酶切行琼脂糖凝胶电泳后,观察到有两条条带,显示Lenti-IRES-puro骨架获取成功。rtta基因片段行琼脂糖凝胶电泳后,观察到在1kbp附近有条带,显示rtta基因片段获取成功。克隆的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒经酶切行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,经基因测序结果为100%正确,显示Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒构建成功。重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞,感染后48小时收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒浓缩液滴度为:6.5*10^7TU/ml,感染后72小时收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒浓缩液滴度为:5.7*10^7TU/ml。2、Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4载体经酶切后行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,显示Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架获取成功。采用RT-PCR技术从人胚胎干细胞总RNA中获取人Numb基因片段行琼脂糖凝胶电泳后,观察到在2kbp处有条带,显示人Numb基因片段获取成功。克隆的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒经酶切后行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,经基因测序结果为100%正确,显示Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒构建成功。重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞,感染后48小时收集的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb病毒浓缩液滴度为:3.5*10^7TU/ml,感染后72小时后收集的LentiEF1a-EGFP-TRE-Numb病毒浓缩液滴度为:2.5*10^7TU/ml。结论:1、含有四环素调控人Numb基因过表达调控组份的Lenti-EF1a-RTTA-IRE S-Puro慢病毒载体构建成功。2、含有四环素调控人Numb基因过表达反应组份的Lenti-EF1a-EGFP-TRENumb慢病毒载体构建成功。