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锌(Zn)作为一种营养元素在植物体内发挥着重要的作用,是植物体内多种酶的必需成分,对植物的生长发育有着很重要的作用。随着人类排放的废物废水的增多,大量的重金属进入土壤中。当土壤中大量的锌元素被植物吸收后,会导致植物的生长受到抑制,严重时会导致植物死亡。当植物在高含量锌的土壤中生长时,自身也会有一系列的抗逆机制来应对高锌胁迫。目前大部分的研究都集中在锌转运子上,对锌解毒的转录因子及其调控机理的研究很少。本研究的目的是初步阐明大青杨PuHSFA4a转录因子调控高锌胁迫应答的分子作用机制。(1)在大青杨中克隆了 PuHSFA4a转录因子,发现这个转录因子能够特异性地提高大青杨的抗高锌能力。在大青杨受到高锌胁迫后,通过qRT-PCR和GUS染色发现这个转录因子在根部发挥作用。通过亚细胞定位发现这个转录因子定位于细胞核和细胞质中,说明了这个转录因子是组成型表达蛋白。转录自激活实验展现出PuHSFA4a的转录激活区域在蛋白序列上的214 AA到278 AA处,包含一个AHA1激活部位。(2)将获得的PuHSFA4a过表达、抑制表达转基因株系和野生型大青杨进行高锌胁迫,结果表明:在高锌胁迫下,与野生型大青杨相比PuHSFA4a过表达转基因株系有着更健壮的根系和产生更少量的活性氧(ROS),说明过表达PuHSFA4a基因提高了大青杨的抗高锌能力;而PuHSFA4a抑制表达转基因株系与野生型相比有着更矮小的根系同时产生了更多的ROS,最终对高锌胁迫更敏感了。(3)对PuHSFA4a转录因子抗高锌胁迫的机理进行了更深入的探究。在正常生长和高锌胁迫后,将PuHSFA4a过表达和野生型大青杨的根部进行转录组测序,结果表明:PuHSFA4a转录因子通过调控下游与非生物胁迫相关或者是和根生长相关的基因来提高植物的抗高锌能力。(4)通过染色质免疫共沉淀(ChIP)、酵母单杂实验(Y1H)、双荧光素酶实验(LUC)和凝胶阻滞实验(EMSA)发现:PuHSFA4a结合谷胱甘肽-S-转移酶(PuGSTU17)和马铃薯糖蛋白型磷脂酶(PuPLA2)基因启动子上的HSE元件从而直接调控这两个基因的表达。(5)通过对PuGSTU17转基因株系和野生型大青杨进行表型观察和生理指标测定:发现过表达PuGSTU17基因提高了大青杨根部的GST酶活,降低了根部的ROS水平,最终提高了整个植物的抗高锌能力。对另一个靶基因PuPLA2进行了转基因表型观察:发现在正常生长和高锌胁迫后,PuPLA2过表达株系根部生长比野生型更茂盛。综上所述:PuHSFA4a转录因子一方面通过直接调控PuGSTU17功能基因来提高大青杨根部GST酶活,最终降低了胁迫后产生的ROS。另一方面通过正调控下游靶基因PuPLA2的表达来促进根部的生长,最终提高植物的抗高锌能力。本研究不仅首次发现了热激转录因子能够提高植物的的抗高锌能力,而且拓宽了转录因子调控高锌胁迫的机制。为林木重金属土壤修复提供了理论依据和参考,对于培育出重金属抗逆性强的植物具有重要意义,有很重要的应用前景。