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原发性肝癌是指由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤。为消化系统常见恶性肿瘤之一,死亡率仅次于食管癌与胃癌。其发病后进展迅速,临床确诊时多数患者属中晚期,失去了最佳治疗机会,无法手术切除,多以姑息性治疗为主,其中中医药疗法不仅可以有效控制病情进展,减轻转移复发,还可改善患者生活质量,延长生存时间,故对中医药复方治疗原发性肝癌的研究越来越重视。本研究来源于国家科技重大专项—重大新药创制课题：清肝化瘀胶囊治疗原发性肝癌的候选药物研究(2012ZX09103201-021)。清肝化瘀方是导师姚树坤教授集三十余年临床用药经验而形成的治疗原发性肝癌的有效经验方,由黄芩、苦参、白术、莪术、三棱、半枝莲、白花蛇舌草、甘草等药组成,具有清热解毒,健脾祛湿,活血化瘀,软坚消癥等功效。前期研究显示清肝化瘀方可应用于临床上大多数原发性肝癌患者,疗效确切。具有多环节、多靶点的网络作用特点,能提高患者免疫功能,延长生存期,改善生活质量,具有极高的进一步开发研究价值。本课题优化清肝化瘀方的提取工艺,制成颗粒剂,方便患者服用,采用TCL定性鉴别、有效成分含量测定进行质量控制,结合指纹图谱分析方法,建立清肝化瘀颗粒的标准指纹图谱,对主要色谱峰进行归属,并进行初步药代动力学研究,了解清肝化瘀颗粒主要有效成分在体内的吸收、分布情况。一、清肝化瘀颗粒的提取、制剂工艺研究根据方中中药君臣佐使特点及各中药理化性质、主要有效成分,优选提取工艺如下：黄芩、苦参为方中君药,单独行水提与醇提；莪术、白术两药以挥发油为主要成分,两药合并提取挥发油,并与倍他环糊精进行包合；三棱、半枝莲、白花蛇舌草、甘草4药与莪术、白术提取挥发油后药渣混合后水煎提取,水提液行醇沉精制工艺；各提取液浓缩、干燥,以糊精为辅料,90%乙醇为润湿剂制备颗粒。分别对水提工艺、醇提工艺、挥发油提取工艺、包合工艺、水提醇沉工艺、颗粒剂成型工艺进行优选。二、清肝化瘀颗粒的质量控制研究1、本课题对方中黄芩、苦参、三棱、半枝莲等4味中药进行了TCL定性鉴别,结果显示本研究建立的TCL鉴别方法简单易行,斑点清晰,重现性高,可以对清肝化瘀颗粒的4味中药进行有效鉴别。2、采用高效液相方法建立了黄芩苷含量测定方法,色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Kromasil C18色谱柱(250mm × 4.6mm,5 μm);流动相：甲醇—水—磷酸(43：57：0.2)；柱温：28℃；检测波长：280nm；流速：1mL/min;进样量：10uL。黄芩苷在1.6-9.6μg进样范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9995,其6个样品的平均加样回收率为96.88%,RSD=0.71%。3、采用高效液相方法建立了氧化苦参碱及苦参碱含量测定方法,色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Kromasil C18色谱柱(250mm × 4.6mm,5 μm);流动相：有机相,甲醇-乙腈(1：1)；水相,0.1%氨水溶液；梯度洗脱程序：有机相,O-40min(10%-60%),40-41min(60%-10%),41-50min(10%);流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量为10μL。氧化苦参碱及苦参碱分别在0.44-1.54 μ g及0.11-0.66μg浓度范围内进样量与峰面积呈线性关系,r=0.9995,氧化苦参碱平均加样回收率为100.00%,RSD=2.40%,苦参碱平均加样回收率为99.84%,RSD=1.45%。三、清肝化瘀颗粒的指纹图谱研究本研究对比了不同流动相,梯度洗脱,检测波长等条件,最终确定了清肝化瘀颗粒的高效液相指纹图谱,色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液,梯度洗脱；检测波长：300nm；流速：0.8mL/min;进样量：10uL；柱温：28℃。在该条件下选定了25个共有峰为指纹图谱特征峰,通过与方中单味药材指纹图谱的比对,对共有峰进行了鉴别,归纳了共有峰的具体来源,进一步提高了清肝化瘀颗粒的质量控制标准。四、清肝化瘀颗粒的初步药代动力学研究本课题初步研究了清肝化瘀颗粒中有效成分之一氧化苦参碱的药代动力学,其色谱分析方法为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：有机相甲醇-乙腈(1：1)；水相,0.1%氨水溶液；梯度洗脱程序：有机相,0-40min(10%-60%),40-41min(60%-10%),41-50min(10%)；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量为20μL。血浆样品以乙腈行蛋白沉淀萃取。经方法学研究提示,氧化苦参碱在0.55-55.0 μg/mL浓度范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系,其低、中、高3个浓度的平均回收率分别为100.56%、100.07%、102.13%,RSD分别为2.36%、2.60%、1.05%,日内精密度RSD分别为2.60%、2.66%、1.06%,血浆内源性物质对氧化苦参碱的测定无干扰。应用上述高效液相检测方法,SD大鼠经灌胃给药后,药代动力学相关参数为：Cmax为31.6733±1.3512μg/mL, T1/2为2.589786±0.2604h,Tmax为1.5h,Ke为0.2690±0.02591/h, AUCO-10为138.6983±5.1950 μ g/mL*h,AUC0-∞为146.1711±5.6706μg/mL*h。