由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）引起的柑橘衰退病是为害全球柑橘产业的重要经济病害。带病苗木和蚜虫传播是影响柑橘衰退病蔓延流行最重要的因素,前者可造成柑橘衰退病的跨区域传播,而蚜虫传播则是柑橘衰退病在当地开展流行的重要原因。CTV可被多种蚜虫以半持久型的方式传播,其中褐色橘蚜（Aphis citricida）传播CTV的能力最强。褐色橘蚜在传毒时,首先CTV粒子随褐色橘蚜的取食,吸附于褐色橘蚜的前肠,后随褐色橘蚜吐出的唾液感染健康植株,但传毒过程的分子机理尚未被阐明。研究CTV与褐色橘蚜的互作关系将有助于解析褐色橘蚜传播CTV的分子机理,进而为阻断CTV的蚜虫传播过程提供新思路。相关研究表明,病毒与媒介昆虫的互作是病毒蛋白和介体特异性蛋白相互作用的结果,病毒编码的外壳蛋白已被证明是参与此过程的关键因子。在前期研究中,本研究团队分别借助病毒覆盖技术、酵母双杂交技术,以及对带毒与不带毒褐色橘蚜的蛋白组学分析,从褐色橘蚜体内筛选出了多个与CTV外壳蛋白（CP和CPm）具有潜在互作能力的蛋白,但这些蛋白与CTV外壳蛋白互作的真实性尚未得到进一步的验证。为此,本研究根据媒介昆虫传播半持久型病毒的特点,从78个具有潜在互作能力的褐色橘蚜蛋白中选择了20个在褐色橘蚜头胸部表达的膜蛋白或分泌蛋白,借助一对一酵母双杂交和GST-pull down互作技术,鉴定出了可与CTV外壳蛋白真实互作的褐色橘蚜蛋白。主要研究成果如下:1、潜在互作蛋白的筛选。运用亚细胞预测网站对前期研究中获得的78个褐色橘蚜蛋白进行亚细胞定位预测,筛选出15个跨膜蛋白或分泌蛋白,同时根据相关研究,在褐色橘蚜转录组数据库中筛选了5个可能参与介体传播非持久型病毒的角质层蛋白的同源序列。进而运用RT-q PCR法,明确编码这20个蛋白相应的基因在褐色橘蚜的头胸部均有表达,其中MPCP1、MPCP2、MPCP4、Sylin02、FLCPR2、PDR、AC9786、Cup20和NP9398基因的表达量较高,均高于看家基因α-Tubulin。序列比对分析显示,褐色橘蚜中的上述20个基因和其他蚜虫中的同源基因在核苷酸水平上的相似性均高于80%。系统发育树结果显示,上述基因在褐色橘蚜和CTV的另一种高效传播介体棉蚜（Aphis gossypii）中的同源基因比其在非CTV媒介蚜虫中的同源基因具有更近的亲缘关2、酵母双杂交证实NP9398与CP存在互作,NP9147与CPm存在互作。构建了分别表达上述20个跨膜蛋白或分泌蛋白的猎物质粒,共转化表达CTV外壳蛋白（CP和CPm）的诱饵质粒于酵母菌NMY51。其中,共转化p PR3N-NP9398与p DHB1-CP的酵母可以在SD/-Trp-Leu-His-Ade营养缺陷型培养基上生长,且长势较好;共转化p PR3N-NP9147与p DHB1-CPm的酵母可以在SD/-Trp-Leu-His-Ade营养缺陷型培养基上生长,但长势较弱;共转上述两组质粒组合的酵母都可激活体内β-半乳糖苷酶基因的表达;共转化其它质粒组合的酵母无法在SD/-Trp-Leu-HisAde营养缺陷型培养基上生长。此结果表明,NP9398与CP存在互作,且两者间的作用力较强。NP9147与CPm存在互作,但两者间的作用力较弱,另外18个蛋白与CP或CPm不存在相互作用。3、GST-pull down证实NP9398与CP存在互作。构建NP9398、NP9147、CP和CPm的原核表达载体（p GEX-4T-NP9398,p GEX-4T-NP9147,p ET-28a-CP和p ET-28a-CPm）,分别转化进大肠杆菌表达菌株Rosetta（DE3）,成功诱导表达,并纯化出了重组蛋白NP9398、CP和CPm。GST-pull down互作验证表明,膜蛋白NP9398与CP存在相互作用,该结果与酵母双杂交结果一致。在尝试构建不同表达载体、不同的诱导条件,以及密码子优化后,依旧无法在大肠杆菌体内表达重组蛋白NP9147,因此暂无法借助GST-pull down验证NP9147与CPm的互作关系。