第一部分:Treg细胞亚群比例异常在ITP中的作用及机制研究免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性自身免疫性疾病,其临床特征是血小板计数下降和出血风险增加。ITP的主要发病机制包括巨核细胞产生血小板异常减少和血小板破坏增多,其中,T细胞免疫失耐受是ITP患者血小板破坏增多的重要因素之一。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg cells)在维持免疫稳态,介导免疫耐受,控制自身免疫性疾病以及抑制针对微生物或过敏原的过度免疫反应中发挥着重要作用。最近的研究表明,Treg细胞由具有不同功能特性的异质群体组成。在某些炎症条件下,部分Treg细胞可以获得辅助性T细胞(T helper cells,Th cells)的表型,并具有分泌炎性细胞因子的能力,比如Thl-like Treg细胞和Th17-like Treg细胞分别可以分泌IFN-γ和IL-17A。在机体生理条件和多种自身免疫性疾病中,已经观察到Thl-like Treg和Th17-like Treg细胞的存在。这两种Treg细胞亚型是否与ITP的发生发展相关目前尚未有文献报道。地塞米松治疗是ITP的一线治疗方案之一,也是临床上常用的糖皮质激素。在自身免疫性疾病中应用大剂量地塞米松治疗可以抑制炎性因子的分泌。本课题组之前的研究发现在ITP中,地塞米松的处理能够抑制脾脏巨噬细胞的M1表型和功能,使其向M2细胞极化,还能够促进血液中骨髓源性抑制细胞产生。但是地塞米松是如何持续性的纠正患者的免疫微环境还不清楚,地塞米松治疗是否通过调控Treg亚群发挥作用在ITP中也尚未有报道。本研究首先利用流式细胞术发现相对于健康对照组,ITP患者外周血中Th 1-like Treg和Th17-like Treg细胞占Treg细胞比例升高。既往文献表明,Th1-like Treg和Th17-like Treg细胞有其特异的分子表达谱,如Thl-like Treg细胞高表达CXCR3和TBX21等,而Th17-like Treg细胞高表达CCR6和RORC等。我们分选出健康对照组和ITP患者的Treg细胞并进行实时定量PCR检测,结果显示ITP患者的Treg细胞中Th1-like Treg和Th17-like Treg细胞特异性分子表达谱相关基因的mRNA相对表达量均升高,这也进一步验证了流式细胞术的结果。此外,我们通过相关性分析发现Th1-like Treg细胞占Treg细胞比例与ITP患者血小板计数成负相关,也与ITP严重程度和糖皮质激素治疗敏感性相关。为了探索ITP患者体内Treg细胞亚群失衡的原因,我们在ITP患者血浆中检测了相关的炎性因子。我们发现多种炎性细胞因子表达升高,包括IFN-γ、IL-12、TNF-α、IL-6和IL-23。进一步的体外细胞培养实验发现,炎性因子IFN-γ、IL-12、TNF-α与Th1-like Treg的分化相关,IL-6、IL-23与Th17-Iike Treg细胞的分化相关。为了探索地塞米松处理对Treg亚群的影响,我们体外培养ITP患者CD4+T细胞并加入地塞米松刺激4天后,分选Treg细胞并进行实时定量PCR检测,分析Treg细胞分子表达谱,结果显示CXCR3和TBX21 mRNA相对表达量低于对照组,CCR6和RORC mRNA相对表达量与对照组无统计学差异,提示地塞米松处理可抑制Th1-like Treg细胞分化。我们通过流式细胞术检测发现地塞米松处理后Treg细胞内T-bet的表达降低,RORyt的表达不变,验证了地塞米松处理可抑制Th1-like Treg细胞分化的结论。本研究通过流式细胞术发现体外地塞米松处理提高了 ITP患者Treg细胞占CD4+T细胞比例,同时降低了 Th1-like Treg细胞占总Treg细胞的百分比。为进一步探究地塞米松调节Th1-like Treg细胞的分子机制,我们通过蛋白免疫印迹实验发现地塞米松处理显著抑制对Th1表型起重要作用的STAT1的磷酸化水平。鉴于STAT1位于IFN-γ受体下游,我们还分别检测了地塞米松处理对体外PBMCs分泌IFN-y的作用以及对外源IFN-γ诱导STAT1磷酸化活化的影响。我们发现地塞米松处理显著抑制IFN-γ的产生和分泌,但是并不影响外源IFN-γ诱导的STAT1磷酸化活化,这表明地塞米松可能通过调节IFN-γ分泌抑制STAT1磷酸化从而抑制ITP患者Th1-like Treg细胞分化。我们的研究不仅发现了 ITP患者体内存在Treg细胞亚群比例异常的现象,即患者外周血中Th1-like Treg和Th17-like Treg细胞占Treg细胞的比例均升高,还发现了 ITP患者体内炎性细胞因子高水平有利于Th1-like Treg和Th17-like Treg细胞分化。此外,本研究发现地塞米松处理能够通过抑制IFN-γ分泌调节Th1-like Treg细胞分化。我们的结果说明了 Treg细胞的分化与ITP的发生发展相关,也提示了地塞米松治疗ITP的潜在机制。第二部分:C5a通过调节Th17/Treg平衡参与ITP发病机制的研究免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种以血小板数目降低引起皮肤粘膜出血或具有出血倾向为主要临床表现的自身免疫性疾病。越来越多的研究表明免疫稳态失衡是ITP的重要发病机制之一,其中辅助性T细胞(T helper cells,Th cells)和调节性 T 细胞(regulatory T cells,Treg cells)功能和比例异常被认为和ITP的发生有关。Th17细胞具有诱发炎症和自身免疫性疾病的功能,刺激多种细胞招募中性粒细胞向感染部位聚集,并介导对细胞外细菌和真菌的免疫,而Treg细胞的主要功能为抑制炎症和免疫反应以维持免疫稳态。因而,探究影响Th17/Treg细胞平衡的机制对于我们理解自身免疫性疾病的发病具有重要意义。补体作为担当对抗微生物入侵的第一道防线,近年来也被发现参与了突触成熟、免疫复合物清除、血管生成、造血干细胞/祖细胞动员、组织再生和脂质代谢等多种生命活动,还能通过影响多种免疫细胞参与许多自身免疫性疾病的发病机制。但是关于补体系统在ITP发病中的作用,目前的相关研究比较有限。C5a是补体激活的重要产物之一,三种补体激活途径(经典途径、旁路途径和凝集素途径)均可产生。C5a受体(C5a receptor,C5aR)广泛分布在多种免疫细胞上,如中性粒细胞、单核/巨噬细胞和肥大细胞等。许多研究表明,C5a可以通过调节抗原提呈细胞间接调控T细胞的增殖和功能。C5a还可通过诱导腹腔巨噬细胞产生IL-6和IL-23,与活化T细胞分泌的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子协同作用,进而参与调节Th17细胞的分化。C5aR除了在粒细胞、抗原提呈细胞上广泛分布之外,在CD4+T细胞上也有较高水平表达,但对于C5a如何直接调控CD4+T淋巴细胞分化的研究比较少。本研究首先利用ELISA检测了 ITP患者血浆中的C5a水平,实验结果显示相对于健康对照组,ITP患者血浆中C5a水平升高。利用实时荧光定量PCR检测ITP患者外周血CD4+T细胞C5aR表达水平与健康对照组相比没有显著差异。随后,我们对ITP患者血浆C5a水平与临床特征进行相关性分析,结果显示ITP患者血浆C5a水平与外周血小板数呈负相关,严重型ITP患者血浆C5a水平显著高于非严重型患者,但患者C5a水平与糖皮质激素治疗敏感性不具有相关性,提示了 C5a与ITP发生发展具有潜在的相关性。为了验证患者外周血中是否存在Th17/Treg细胞平衡失稳,我们通过流式细胞术、ELISA等检测发现ITP患者外周血中Th17细胞占CD4+T细胞的比例升高,Treg细胞占CD4+T细胞比例降低,同时血浆中IL-17A水平升高,IL-10和TGF-β水平降低。为了探究ITP中C5a是否调节Th17/Treg平衡,我们首先进行了相关性分析。结果显示ITP患者血浆C5a水平与Th17细胞比例成正相关,与Treg细胞水平没有相关性。我们进一步通过体外细胞培养、流式细胞术等发现rhC5a处理可以使Th17细胞水平升高,Treg细胞水平降低,C5aR抑制剂能阻断这一调节作用。为进一步探究C5a调节Th17/Treg细胞平衡的分子机制,我们利用蛋白免疫印记法检测了 C5aR下游的PI3K/Akt信号通路和NF-κB信号通路活化水平。实验结果显示,rhC5a处理后的CD4+T细胞PI3K和Akt的磷酸化水平增加,NF-κB活化不显著,而加入C5aR抑制剂后能显著抑制这种调节作用。以上结果提示了 C5a能够通过直接调节T细胞的PI3K/Akt信号通路调节ITP患者Th17/Treg平衡。为了验证C5a是否通过PI3K/Akt信号通路调节Th17/Treg细胞平衡,我们在体外培养体系中用rhC5a联合PI3K抑制剂LY294002处理ITP患者CD4+T细胞之后用流式细胞仪检测Th17/Treg细胞比例。实验结果显示,加入PI3K抑制剂可以抑制C5a对Th17和Treg细胞的调节作用,验证了 C5a通过PI3K/Akt信号通路调节ITP患者Th17/Treg平衡这一结论。综上所述,我们发现ITP患者外周血中存在C5a水平显著升高的现象并且Th17/Treg细胞平衡失稳,其中Th17细胞占CD4+T细胞比例升高,Treg细胞比例降低。相关性分析发现C5a水平和Th17细胞水平具有相关性。机制方面,C5a能够通过CD4+T细胞表面C5aR影响下游PI3K/Akt信号通路进而调节Th17/Treg细胞平衡,进而参与ITP发病机制。C5a对Th17/Treg细胞平衡的这一调节作用,揭示了 ITP中T细胞稳态失衡可能的潜在原因,也为临床ITP的治疗提供了新的思路和潜在的靶点。