研究背景和目的汉坦病毒(Hantavirus，HTVs)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，是一种分节段的负链RNA病毒。病毒基因组由小(S)，中(M)，大(L)三个片段组成，分别编码病毒的核衣壳蛋白(NP)，包膜糖蛋白前体以及RNA依赖的RNA聚合酶。包膜糖蛋白前体以共翻译后切割的方式产生G1和G2糖蛋白，并经由N-连接的糖基化修饰。汉滩病毒的包膜糖蛋白上共有五个糖基化位点，其中四个位于G1上(N134，-235，-347，-399)，另一个位于G2上(N928)。通常N-连接的寡糖链可以通过多种方式影响蛋白质的功能，包括促进蛋白的正确折叠，保持蛋白构象的稳定性，防止蛋白酶的消化等。我国是汉坦病毒流行危害最严重的国家，全世界90％以上的肾综合征出血热(HFRS)的病例发生在我国。肾综合征出血热在我国主要是由汉滩病毒(HTNV)和汉城病毒(SEOV)两型病毒引起的。因此我们选择汉滩病毒A9株，84FLI株以及汉城病毒L99株作为研究对象。病毒的包膜与宿主细胞膜的融合是包膜病毒进入细胞的第一步。正是这一膜融合的过程导致病毒的蛋白和基因组RNA进入宿主细胞，从而开始病毒的感染周期。包膜病毒不仅可以介导病毒包膜与宿主细胞膜之间的融合而且还可以介导细胞-细胞间的融合。对其他包膜病毒的大量研究表明，这一膜融合的过程是由表达在细胞表面的病毒的包膜糖蛋白(或者称为融合蛋白)所介导的。病毒的融合蛋白包含一个重要的结构区称为融合肽(fusion peptide)，在融合过程中起着重要作用。一般认为病毒介导的膜融合的过程包括下列阶段：融合蛋白构象的改变、融合肽的暴露、融合肽插入胞体膜、过渡的中间体的形成并最终伴随着能量的转移将两个膜拉向一起，从而完成病毒膜与宿主细胞膜的融合过程。病毒的融合蛋白所介导的膜融合是病毒进入宿主细胞最重要的步骤，因此清楚的阐明这一过程将有助于新的药物以及疫苗的产生，从而阻断病毒的感染。在其它的包膜病毒中，利用分析病毒膜融合的过程已经产生了针对病毒进入的新的治疗策略。例如，防治HIV感染的恩福韦得(enfuvirtide)就是在研究HIV gp41所介导的膜融合的基础上研制出来的。此外，由于许多其它的包膜病毒利用同样的机制进入宿主细胞，因此我们可以利用相似的治疗策略来防治许多的病毒性疾病。作为包膜病毒的一种，汉坦病毒感染宿主细胞时，它的包膜也必须与宿主细胞膜融合，允许病毒的内容物进入宿主细胞。尽管汉坦病毒在酸性环境下可以引起细胞-细胞间融合的现象已经发现了二十多年，但是关于它的融合活性位点的确切定位以及导致这一过程的机制目前我们仍然知之甚少。已有的研究表明汉坦病毒的包膜糖蛋白可能参与了这一过程。此外，最近有国外学者用蛋白质组学计算机分析的方法发现布尼亚病毒的G2糖蛋白与其它包膜病毒(甲病毒、黄病毒等)的融合蛋白在结构上非常相似，而且有一段内在的结构区(在汉滩病毒位于氨基酸的第763-785位)在所有的布尼亚病毒的G2蛋白上都是保守的且有着相似的定位。因此推测G2蛋白可能是汉坦病毒的融合蛋白，而这段高度保守的结构区则可能是它的融合肽。尽管有上述研究进展，但是这些假说都缺乏足够的证据支持。在本研究中我们在分子水平上对汉坦病毒致细胞融合的机制进行了初步探讨，对上述假说提供了直接的证据。具体的实验内容分述如下：第一部分：汉坦病毒具有融合活性的结构蛋白基因片段的初步确定在本部分实验中我们利用真核表达载体分别将三株汉坦病毒(两株汉滩病毒，一株汉城病毒)的核蛋白(NP)和糖蛋白(GPs)在Vero E6细胞中进行了单独表达以及共表达，然后进行了细胞融合实验，结果证明汉坦病毒M片段编码的糖蛋白具有融合活性，能够独立的引起细胞融合。材料和方法：1．我们将三株病毒(两株汉滩病毒，一株汉城病毒)的核衣壳蛋白和糖蛋白的基因S、M片段的编码区分别插入到含CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.0中，构建了六种表达汉坦病毒结构蛋白的重组表达载体。2．采用脂质体法将每株病毒的糖蛋白和核蛋白的重组表达载体都进行了单独转染以及共转染Vero E6细胞。3．采用间接免疫荧光实验(IFA)以及免疫沉淀实验鉴定目的基因在真核细胞中的表达。4．流式细胞仪分析结构蛋白的细胞表面定位。5．蛋白表达后进行细胞融合实验及其抑制实验。结果：1．间接免疫荧光实验以及免疫沉淀实验表明三株汉坦病毒的包膜糖蛋白及核蛋白都能在Vero E6细胞中表达。2．流式细胞仪分析表明只有糖蛋白能够定位于细胞表面，而核蛋白则不能被转运于细胞表面。3．在细胞融合实验中，单独表达糖蛋白的细胞中可以观察到细胞融合，而单独表达核蛋白的细胞中则未出现融合现象，且将糖蛋白与核蛋白共表达并不能增强融合的强度。4．在细胞融合抑制实验中，只有糖蛋白的单抗能阻断细胞融合，而核蛋白的单抗则对融合活动没有明显影响。5．尽管融合强度有所差异，三株病毒都出现了相似的融合结果。结论：1．汉滩病毒M片段编码的包膜糖蛋白可以独立的介导细胞融合，这一过程不需要病毒的核衣壳蛋白以及RNA聚合酶的参与。2．汉城病毒也表现出这一特征，因此这有可能是汉坦病毒属共有的特征。第二部分：N-连接的糖基化在汉滩病毒糖蛋白致细胞融合活动中的作用在本部分实验中我们调查了汉滩病毒A9株包膜糖蛋白上的糖基化位点对融合活动的影响。结果发现G2上的N-连接的糖基化对于细胞融合是必不可少的。考虑到该糖基化位点对维持G2蛋白的功能所起的重要作用我们认为很可能G2就是汉滩病毒的融合蛋白。材料和方法：1．我们利用基因定点突变的方法构建了八个基因突变的糖蛋白变异体，包括五个单突变和三个双突变。为了构建糖基化位点突变的糖蛋白突变体，我们将G1和G2上一个(单突变)或两个(双突变)糖基化位点上的天冬酰胺置换为丙氨酸。根据被替换的位置，突变体分别被命名为：N134A、N235A、N347A、N399A、N928A、N235／928A、N347／928A、N399／928A。2．突变体同样分别在Vero E6细胞中进行瞬时表达。然后采用免疫沉淀和流式细胞仪分析来检测它们的表达和细胞表面定位。3．蛋白表达后进行细胞融合实验。结果：1．免疫沉淀的结果表明，糖蛋白变异体的分子量有明显的漂移。在单突变的分子量大约减少了3000Da；双突变则大约减少了6000 Da。这与此前的报道中丢失了一个或者两个寡糖链的糖蛋白的分子量相符。这些结果表明点突变确实导致了糖基化位点的破坏。2．流式细胞仪分析表明，除了突变体N134A仅表达了G2并且没有能转运到细胞表面以外，其它的糖基化缺失的蛋白突变体都能够在细胞表面表达。3．在转染突变体N134A的细胞中没有发现细胞融合活动，其原因可能是没有相关蛋白在细胞表面表达。4．其它糖基化缺失的突变体中，G1上糖基化的缺失对细胞融合没有影响，而G2上的N-连接的糖基化(N928)的缺失则导致融合活动的消失。结论：G2上的N-连接的糖基化对于融合活动是必须的，而G1上糖基化的缺失则对融合活动没有明显影响。考虑到N-连接的糖基化对于维持蛋白功能的重要作用，我们有理由认为G2很可能是汉滩病毒的融合蛋白。第三部分：汉滩病毒包膜糖蛋白上融合肽的初步确定在本部分实验中我们调查了汉滩病毒A9株G2蛋白上一段高度保守的结构区(氨基酸残基763-785)在融合活动中的作用。结果我们发现此保守区与膜融合密切相关，很可能是病毒的融合肽。材料和方法：1．我们选取G2上一段高度保守的结构区(氨基酸残基763-785)上具有结构重要性的氨基酸进行了基因定点突变，使其置换为性质相左的其他氨基酸。我们共构建了十一个基因突变的糖蛋白变异体，根据糖蛋白突变体上氨基酸被替换的位置将突变体分别命名为：C765S、P767D、D769A、C770S、P771D、G772D、G774D、G776D、C777S、C780S、D785A。2．突变体分别在Vero E6细胞中进行瞬时表达。然后采用免疫沉淀和流式细胞仪分析来检测它们的表达和细胞表面定位。3．蛋白表达后进行细胞融合实验。结果：1．丙氨酸置换769位以及785位的天冬氨酸对细胞融合活动以及蛋白的细胞表面表达都没有影响。2．天冬氨酸置换767位和771位的脯氨酸以及丝氨酸置换780位的半胱氨酸导致G2糖蛋白的错误折叠，从而不能转运到细胞表面，因此未能观察到细胞融合。3．天冬氨酸置换772位、774位、776位的甘氨酸以及丝氨酸置换765位、770位、777位的半胱氨酸可以完全阻断细胞融合的出现而不影响糖蛋白的表达和转运。结论：此保守区多个特定的氨基酸的突变均可以完全阻断细胞融合的出现而不影响糖蛋白的表达和转运。这强烈提示此保守区与膜融合密切相关，很可能是病毒的融合肽。