论文部分内容阅读
降胆固醇首选畅销药物立普妥可用于降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，极具临床应用价值。(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯[(S)-CHBE]是合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的关键前体物质，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂则是其合成立普妥药物的有效成分。前期工作中，本课题组通过基因挖掘的策略从天蓝色链霉菌中成功筛选到NADH依赖型的醇脱氢酶ScCR1。酶学性质表征表明，天然酶ScCR1对4-氯-乙酰乙酸乙酯(COBE)的催化效率较低，且在不对称还原COBE合成（S)-CHBE的反应中，热稳定性较差，成为ScCR1工业应用的瓶颈。因此，本课题旨在通过蛋白质工程提高ScCR1对COBE的催化效率及其自身热稳定性，以提高ScCR1不对称还原COBE的效率。主要研究内容如下: 第一部分ScCR1的催化效率改造。根据晶体结构分析和分子对接结果，对羰基还原酶ScCR1的底物结合口袋进行半理性设计。经过半理性设计和随机突变后，得到一个对COBE催化活力显著提高且热稳定性也小幅提高的突变体M3(I158V/P168S)。M3对COBE的催化活力从38.8 U/mg protein提高到168 U/mg protein，kcat/KM从34.9 s-1 mM-1提高到196 s-1 mM-1;表征M3热稳定性的T1550（保温15 min后残余活力降低一半时对应的温度）也从47.4℃提高到了49.2℃。 第二部分ScCR1的热稳定性改造。以突变体M3作为热稳定性定向进化的母本，采用随机突变的策略进行热稳定性的改造，获得一株热稳定性大大提高的突变体M4(A60T/I158V/P168S)。以M4作为下一轮理性设计的母本，得到一个T1550（在50℃条件下保温15分钟后，蛋白活力降低一半时对应的温度）提高7.5℃的突变体M7(A60T/I158V/P168S/E149M)，但其对COBE的催化活力下降为突变体M4的80％且蛋白表达量较低，故选取突变体M4进行后续研究。突变体M4的Tm值（酶蛋白解链一半时所对应的温度）由野生酶的50.7℃提高到了58.1℃，在50℃的半衰期也提高了3倍多，对底物COBE的耐受性C1550（保温15 min后残余活力降低一半时对应的底物浓度）从34 mM提高到了162 mM，大幅提高了ScCR1的稳定性。突变体M4对COBE的催化活力也提高了6倍，从38.8 U/mg protein提高到260 U/mg protein，kcat/KM从34.9 s-1 mM-1提高到234 s-1mM-1。 第三部分突变体M4的应用研究。在与辅底物异丙醇偶联进行辅酶循环的条件下，突变体M4和野生酶WT分别催化还原COBE，并考察了反应过程中催化剂的催化效率与操作稳定性。从纯酶、冻干细胞、冻干粗酶粉三个角度进行10 mL的反应，M4均表现出更好的催化效率及稳定性。利用突变体M4催化COBE不对称还原合成(S)-CHBE进行放大制备，反应体系为300 mL(水相∶甲苯=1∶1，v/v)，加入30 g的底物COBE(200 g/L)，反应9h后转化率达到99％，ee值＞99％，分离得率为95％，时空产率高达255 g/(L*d)。