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在矫形外科领域,因创伤、肿瘤、感染等原因导致的骨折以及骨缺损的重建常常需要外科手段的干预。到目前为止,在诸多的治疗方法中,自体松质骨移植仍被认为是骨缺损治疗的金标准。但是松质骨移植存在一些缺点,例如供区组织有限,增加患者手术痛苦与风险等。特别是在针对大段骨缺损的修复时,这些问题显得尤为突出,这无疑限制了自体松质骨移植技术在临床中的应用。近年来,随着组织工程研究的兴起,尝试通过构建骨组织工程复合体来修复骨缺损逐渐成为研究的热点。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。因此在本课题中,我们探讨了一种新型来源干细胞-脂肪干细胞的分离、培养、多向分化鉴定以及体外成骨诱导分化潜能,通过使用I型胶原凝胶悬浮脂肪干细胞进而与一种新型三维多孔支架材料PLGA-β-TCP复合从而设计构建了一种新型的仿生骨组织工程复合体,并通过体外、异位成骨分化研究以及进一步用于骨缺损修复治疗,从而对其潜在的临床应用价值进行了详细、充分的检测、评估。本课题主要从以下三个方面进行了研究:1、兔脂肪干细胞(rabbit adipose-derived stem cells, rADSCs)的体外分离培养鉴定及成骨诱导分化研究自3月龄成年日本大耳白兔肩胛间区分离获取皮下脂肪组织,用I型胶原酶消化获得rADSCs。STRO-1蛋白免疫细胞化学染色鉴定所获细胞的干细胞性质;分别加入条件培养液对所获细胞进行骨、软骨、脂肪多向诱导分化鉴定;其中在成骨条件培养液作用下,对rADSCs的体外成骨诱导分化潜能进行充分的评估,依次进行形态学、I型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积相关检测。结果显示原代所获细胞的STRO-1蛋白表达阳性,进一步多向诱导分化鉴定证实rADSCs具有骨、软骨、脂肪多向分化能力。此外,在成骨诱导分化过程中,成骨过程阶段性特异性标记物: I型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达。因此,在兔皮下脂肪组织中分离得到了具有多向分化能力的干细胞,并展现出了良好的成骨分化潜能,为骨组织工程提供了一种新的种子细胞。2、基于兔脂肪干细胞+I型胶原凝胶+PLGA-β-TCP的新型仿生骨组织工程复合体的构建及其体外、体内成骨分化研究使用I型胶原凝胶将第三代rADSCs悬浮并与PLGA-β-TCP支架复合,设计构建成含有rADSCs、I型胶原凝胶以及PLGA-β-TCP支架的骨组织工程复合体(rADSCs-COL/PLGA-β-TCP),同时设立单纯细胞与材料复合体组( rADSCs/PLGA-β-TCP )、无细胞I型胶原凝胶与材料复合体组(COL/PLGA-β-TCP)以及空白材料(PLGA-β-TCP)作为对照。在体外于成骨诱导培养液中培养2w后移植于自体两侧股部肌袋以检测其体内成骨分化情况。移植8w后处死动物,依次进行X线拍片检查以及组织学染色分析。碱性磷酸酶活性以及细胞外基质矿化程度相关检测显示,rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体组成骨分化潜能远优于rADSCs/PLGA-β-TCP复合体组。在异位成骨实验中,放射学检测提示rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体组移植物均呈高密度钙化影,而rADSCs/PLGA-β-TCP复合体组没有明显的钙化组织形成(n=4)。此外,COL/PLGA-β-TCP复合体组、PLGA-β-TCP复合体组亦无影像学阳性表现(资料未提供)。HE染色显示在rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体中新生骨组织均匀充满于材料孔隙中,而在rADSCs/PLGA-β-TCP复合体中,仅仅在少数孔隙中可以看到新生骨组织,大部分孔隙并没有组织长入,而且由于材料的降解已经发生坍塌(n=4)。此外,在COL/PLGA-β-TCP复合体组以及PLGA-β-TCP单纯材料组没有观察到新生骨形成。组织学半定量分析提示,rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体组新生骨组织面积比例要远高于rADSCs/PLGA-β-TCP复合体组(p < 0.05, n = 4)。综上所述,体外成骨分化研究以及体内异位成骨实验显示,I型胶原凝胶能够有效促进rADSCs在PLGA-β-TCP材料中的成骨分化以及均质骨组织的形成。rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体作为新生仿生骨组织工程复合体为骨组织工程复合体的构建提供了一条新的思路。3、应用新型仿生rADSCs-COL/PLGA-β-TCP骨组织工程复合体修复兔自体桡骨缺损为了进一步观察新型仿生rADSCs-COL/PLGA-β-TCP骨组织工程复合体的成骨潜能,在本实验中我们尝试将rADSCs-COL/PLGA-β-TCP骨组织工程复合体用于修复自体桡骨1.5cm骨缺损模型。首先于兔两侧桡骨建立1.5cm骨缺损模型,分别植入rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体、rADSCs/PLGA-β-TCP复合体、COL/PLGA-β-TCP复合体、单纯PLGA-β-TCP材料,同时设立空白对照,动物样本总量为30只。分别于术后12w、24w、36w取材,行X线拍片检测并对结果做Lane-Sandhu X线评分。此外,对于术后36w所取组织还要进行microCT扫描检查。然后将组织进行脱钙处理后石蜡切片,依次行HE染色以及改良丽春红三色法染色,并对新生骨组织形成情况以及材料降解情况进行半定量分析。X线拍片显示,rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体组骨缺损修复效果最为理想,并于术后36w得到完全修复( n=4 ),而rADSCs/PLGA-β-TCP复合体组、COL/PLGA-β-TCP复合体组、单纯PLGA-β-TCP材料组骨缺损并未得到任何程度的修复(n=4)。通过对术后36w所取标本进行microCT扫描检测也进一步证实了rADSCs/PLGA-β-TCP复合体组骨缺损得到了完全修复。此外,对各组Lane-Sandhu X线评分进行统计学分析可以看出,rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体组骨缺损修复效果要明显高于其他四组(p < 0.05,n=4)。组织学观察结果与放射学检测相类似,在rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体组,术后12w新生骨组织均匀的分布于材料孔隙内(n=4);术后24w骨断端的连续性已经基本恢复,但髓腔尚未再通,在髓腔内还可见材料残余(n=4);术后36w,骨断端的连续性已经完全恢复,髓腔已经基本再通( n=4 )。而rADSCs/PLGA-β-TCP复合体组、COL/PLGA-β-TCP复合体组、单纯PLGA-β-TCP材料组并没有观察到有明显的新生骨组织长入(n=4)。组织学半定量分析提示rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体组的新生骨组织面积比例以及材料降解速率均显著高于其他四组(p < 0.05, n=4 )。总之,通过自体骨缺损修复实验进一步证实了rADSCs-COL/PLGA-β-TCP复合体所具有的良好的成骨分化潜能,从而为骨组织工程复合体的构建以及应用开辟了一条新的途径。