目的:当前,恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的一大杀手,严重地影响了人们的生活质量、生存健康。因此研究肿瘤的发病机理、研究开发高效抗肿瘤药物,帮助肿瘤患者早日摆脱病痛折磨、提高生存质量、延长生命成为肿瘤研究工作者的当务之急。过去认为肿瘤是由于细胞内癌基因被激活,导致细胞获得无限增殖能力;或者是由于细胞在分化发育过程中通路受阻,不成熟细胞呈克隆性扩增,细胞发育被阻滞于一定的分化期而发生的。近年来随着对细胞凋亡研究的深入,肿瘤学家们发现细胞凋亡调控的失调也是细胞癌变的重要机制之一。甚至有观点认为肿瘤细胞可能起源于本应该凋亡而未发生正常凋亡的细胞。随着研究的深入,人们认识到细胞凋亡是一种与细胞坏死有着不同的形态和生化特征,且受基因调控的细胞主动死亡的过程。通过诱导细胞凋亡杀伤肿瘤细胞,不会引起机体强烈的炎症反应,可在杀伤肿瘤细胞的同时保护机体的正常组织。因此开发研究诱导肿瘤细胞凋亡的药物越来越受到研究者的关注。三氧化二砷(Arsenic Trioxide,As2O3)是传统中药砒霜中的主要成分,低剂量的三氧化二砷早已载入我国中药史册。近年来其抗肿瘤活性已有陆续报道,其对多种肿瘤细胞具有抑制增殖,诱导细胞凋亡或分化的作用。这使得其在抗肿瘤方面具备了良好的应用前景。顺铂是临床上常见的抗癌药物,国内外相关文献认为顺铂有广泛的抗肿瘤作用,可治疗多种晚期癌症,如:卵巢癌、肺癌等。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,而且发病率目前有增高趋势。因而对乳腺癌的预防和治疗等研究成为肿瘤研究领域的一大热点课题。本文以人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤模型为研究对象,探讨三氧化二砷联合顺铂对抑制人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的作用性质及其相互作用机制。方法:将MCF-7细胞于37℃,5%CO2等常规条件下传代培养,待细胞进入对数生长期后用0.25%胰酶、0.02%EDTA消化,收集并调整为2×107/ml细胞悬液备用。1复制人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤模型:每只裸鼠取1个注射点,用上述细胞液0.1ml注射于前肢腋下,接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿,按规定时间测量肿瘤体积大小,以肿瘤直径0.5cm为成瘤。2病理学观察:标本(包括心脏、肝脏、肾脏)在10%的福尔马林溶液中固定,常规石蜡包埋后,行HE染色,以评价移植瘤细胞在光学显微镜下的病理变化。3透射电子显微镜观察:从剥离的瘤体上取下一块组织用眼科剪剪成1mm×1mm×1mm小块,用体积分数为4%戊二醛4℃前固定,1%饿酸后固定,乙醇系列脱水,最后用Epon812环氧树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸铀-柠檬酸铅双重染色,电镜下观察并照相。4流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡、细胞周期分布:从剥离的瘤体上取下一块组织用眼科剪剪成2mm×2mm×2mm的小块,放置于事先预冷的70%乙醇中,4℃固定过夜。将固定组织剪碎,混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块,收集细胞悬液,离心,弃上清,用PBS调整细胞浓度为1×107/ml。取100ul此细胞悬液加入碘化丙啶(PI)1ml,4℃避光染色30min,用流式细胞仪行DNA含量分析。5用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中Survivin mRNA的表达:利用TRIZOL试剂盒提取移植瘤组织实验组和对照组RNA,反转录、扩增后得到的PCR产物经8%聚丙烯酰氨凝胶电泳,溴化乙锭(EB)显色,Bio-profif凝胶图像分析系统进行摄像分析。6 FCM检测Survivin蛋白的表达:取移植瘤组织制成的单细胞悬液1×106/ml,按常规方法进行荧光标记,用流式细胞仪检测其荧光强度,以荧光指数(FI)表示蛋白的表达情况。结果:1皮下接种5天后明显成瘤,成功建立了裸鼠皮下移植瘤模型,接种成功率为100%。2病理学检查用药组和对照组相比可见肿瘤细胞减少,形态模糊,核分裂相少见等,尤以联合用药组明显。3经联合用药后,取肿瘤组织在透射电镜下观察发现:核染色质呈团块状,呈典型的凋亡细胞形态学改变—细胞质浓缩,核碎裂,染色质浓缩边集。而单药组三氧化二砷和顺铂组则无上述典型表现:细胞核大而畸形,胞浆内较多粗面内质网,并有脱颗粒现象;囊池有不同程度的扩张;线粒体有不同程度的肿胀、空泡变,部分嵴融合消失。4流式细胞仪检测三氧化二砷组、顺铂组和联合组的肿瘤组织均可见有G0/G1期前细胞形成的凋亡峰,三氧化二砷组S期、G2/M期细胞明显增多,据结果分析三氧化二砷可能的药效是将细胞生长周期主要阻滞于S期、G2/M期,而顺铂药效则是将细胞周期主要阻滞于G2/M期,联合用药组则主要表现为G0/G1期细胞增多,说明细胞可能主要被阻滞于G0/G1期。对照组、三氧化二砷组、顺铂组和联合组凋亡率分别为5.4%、26.4%、21.9%、36.9%。Survivin蛋白表达降低,荧光指数分别是1.00、0.65、0.70、0.40。5 RT-PCR结果表明:实验组Survivin mRNA条带强度减少,并明显低于对照组,联合组与三氧化二砷组和顺铂组比较条带强度减少显著,而单一用药组中三氧化二砷组和顺铂组比较无明显差异。结论:1低剂量三氧化二砷和低剂量顺铂联合应用比其高浓度单独应用对乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤有更明显的抑制作用。2三氧化二砷和顺铂联合抗乳腺癌的作用机制可能与下调Survivin的表达有关。