人参是一种具有重要经济价值的传统珍稀药用植物,其主要活性成分是三萜类化合物——人参皂苷。通过人参种植或人参细胞培养来获得人参皂苷十分困难,成本高昂。随着代谢工程和合成生物学的发展,在微生物中构建人参皂苷的生物合成路径的研究引起了很大关注。鉴于毕赤酵母十分适于大规模工业化生产应用,本课题试图在毕赤酵母中构建人参皂苷前体的高效生物合成路径,以期开发可以高效生产人参皂苷的微生物菌种。本课题的工作基于毕赤酵母原有麦角甾醇三萜合成途径,在环氧角鲨烯处引入一条人参皂苷合成的人工代谢支路,本论文主要围绕环氧角鲨烯向人参皂苷关键前体达玛烯二醇的转化开展相关工作。首先引入达玛烯二醇合成酶基因(PgDDS),利用pPIC3.5K质粒将其导入毕赤酵母基因组并筛选得到高拷贝子GSKD菌,该酶成功催化环氧角鲨烯生成达玛烯二醇,产量为0.030 mg/g DCW;随后为了增加环氧角鲨烯的供应,通过用AOX启动子共表达角鲨烯单加氧酶基因(erg1)与PgDDS基因得到GSKED菌,使达玛烯二醇的产量提高了约6倍,达到0.203 mg/g DCW;最后为了降低原有代谢途径中环氧角鲨烯向麦角甾醇的代谢通量,开发了毕赤酵母基因Cre-lox无标记打靶工具,通过此工具将GSKED菌羊毛甾醇合成酶基因启动子更换为硫胺素抑制型的PTHI11启动子获得GSKED-PTHI11菌株,培养基中添加硫胺素时抑制麦角固醇合成路径对环氧角鲨烯的消耗,使其更多的转化为达玛烯二醇,又使达玛烯二醇的产量提高了3倍多,达到0.736mg/g DCW;此外,本研究还通过向重组菌株发酵培养基中添加角鲨烯的方式提高环氧角鲨烯前体供应量,使得达玛烯二醇的产量有了进一步提高,达到1.073 mg/g DCW。以上本论文的工作,为进一步开发高效生产人参皂苷的毕赤酵母菌种奠定了良好的基础。