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卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。发病初期症状不明显,绝大多数患者就医时已经发展为晚期,五年总体生存率只有30%,并且预后较差,容易发生腹腔转移,容易复发,对女性生命健康构成严重威胁。异常的同源重组修复(Homologous recombination repair,HRR),高水平的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)以及抗氧化基因上调是卵巢癌的典型特征,而调控卵巢癌氧化还原稳态的分子机制仍不明确。因此,探究卵巢癌氧化还原稳态的调控机制,探寻有效的药物作用靶点是卵巢癌研究面临的重要挑战。同源重组修复缺陷是造成卵巢癌对铂类耐药的主要原因。同源重组修复在DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)修复过程中发挥关键作用。RAD51蛋白的重组酶活性是催化DSBs同源重组修复的核心。此外,RAD51介导的同源重组(Homologous recombination,HR)在哺乳动物细胞促进DNA高效复制方面也起着关键作用。研究表明RAD51在多种肿瘤中表达上调并且RAD51表达水平与患者不良预后相关。RAD51还与肿瘤耐药有关,下调RAD51的表达可以增强肿瘤对放疗及化疗的敏感性。由于RAD51蛋白是催化HRR的关键蛋白,因此我们认为RAD51过表达赋予肿瘤细胞的放疗及化疗抗性可能与DNA修复能力的增强有关。而有报道称HRR通路另一关键的调控蛋白BRCA1可以通过上调Nrf2的表达发挥抗氧化作用,这提示我们DNA修复蛋白可同时发挥抗氧化作用。最近的研究还发现,细胞核DNA损伤可以引发线粒体应激,而线粒体ROS增多又可以加剧细胞核DNA损伤。ROS在多种细胞内的代谢过程中不可或缺。虽然很容易理解提高抗氧化能力是卵巢癌细胞应对氧化压力所必须的,HRR蛋白是否间接促进氧化还原稳态的维持仍有待探究。此外,HRR缺陷是否会引发线粒体反应尚不明确。本研究探究了 RAD51在人卵巢癌细胞线粒体稳态维持及氧化应激调控中的作用。为了明确卵巢癌中RAD51的表达水平,我们首先利用Oncomine TM工具分析了RAD51在正常卵巢、腹膜及卵巢癌组织中mRNA的表达差异,结果显示RAD51在卵巢癌组织中的mRNA水平显著高于对照组织。接着,我们通过qPCR检测了RAD51在46例高级别浆液性卵巢癌(High grade serous ovarian cancer,HGSOC)和20例输卵管伞上皮(Fallopian tube epithelia,FT)组织中的mRNA表达水平。发现RAD51在HGSOC中的mRNA表达水平显著高于FT。同时我们通过免疫组化实验检测了 41例FT组织,228例HGSOC组织中RAD51的蛋白表达水平,同样发现RAD51在HGSOC中的表达明显高于FT。我们还利用Kaplan-Meier Plotter工具分析了RAD51表达水平与卵巢癌患者预后的关系。发现高表达RAD51的患者预后比较差。这些结果表明RAD51在卵巢癌中表达上调并且与卵巢癌患者不良预后相关。随后,我们探究了 RAD51在卵巢癌中高表达的生物学意义。我们利用siRNA及shRNA干预卵巢癌细胞中RAD51的表达,采用平板克隆形成及EdU掺入实验检测细胞的增殖能力,同时检测细胞周期分布和凋亡情况。结果表明敲低RAD51可以引起卵巢癌细胞增殖障碍及G2/M期停滞,但不影响细胞凋亡。利用裸鼠皮下成瘤实验检测敲低RAD51以后对卵巢癌细胞成瘤能力的影响,发现敲低RAD51可以抑制肿瘤生长,并且,RAD51敲低组裸鼠的肿瘤组织中Ki-67染色强度显著减弱。课题组的前期研究发现,在氧化压力条件下,过表达RAD51可以促进卵巢癌细胞增殖。并且,过表达RAD51可以降低H2O2诱导的ROS水平。提示我们卵巢癌中RAD51高表达可能具有抵抗氧化压力的作用。随后,我们利用siRNA及抑制剂抑制RAD51以后检测细胞内的ROS水平,发现这两种处理均可以增加卵巢癌细胞内的ROS水平。此外,敲低RAD51之后8-OHdG表达显著增加,RAD51敲低组小鼠肿瘤组织中8-OHdG的表达也明显增加。为了探究敲低RAD51导致的细胞增殖障碍是否由ROS介导,我们用抗氧化剂NAC处理RAD51干扰组及对照组细胞后通过EdU掺入、CCK-8及平板克隆形成实验检测卵巢癌细胞的增殖能力,发现NAC能够部分拯救敲低RAD51导致的卵巢癌细胞增殖障碍,NAC还可以减少RAD51缺乏导致的DNA双链断裂标记γ-H2AX积累。线粒体是ROS产生的主要场所之一。接下来,我们探究了敲低RAD51产生的ROS是否来源于线粒体。我们检测了敲低RAD51之后线粒体特异性超氧化物MitoSOX的水平,发现敲低及抑制RAD51均能明显升高卵巢癌细胞内的MitoSOX水平。不仅如此,用线粒体特异性抗氧化剂MitoQ处理卵巢癌细胞也可以显著降低敲低RAD51引起的ROS水平。而且,敲低RAD51之后,线粒体膜电位降低,线粒体最大耗氧能力增强,糖酵解能力增强。说明敲低RAD51可以引起线粒体功能失调。我们认为卵巢癌细胞内敲低RAD51引起的OCR(Oxygen consumptionrate,OCR)增加可能与线粒体总量的增多有关。于是我们用Mitotracker标记线粒体,通过流式细胞术对线粒体总量进行检测。发现敲低RAD51或者抑制剂处理均可以导致线粒体总量明显增多。接下来,我们又对抑制RAD51导致线粒体总量增多的机制做了进一步探究。文献报道处于G2/M期停滞的细胞通常比处于其他细胞周期阶段的细胞具有更多的线粒体和更高的ROS水平。由于CHK1通常介导G2/M期停滞,而敲低RAD51又可以导致卵巢癌细胞G2/M期停滞,因此,我们推测CHK1可能介导RAD51缺失导致的G2/M期停滞和线粒体氧化压力。进一步的实验结果显示,敲低RAD51可以激活CHK1,而抑制CHK1可以部分消除敲低RAD51引起的G2/M期停滞。此外,敲低RAD51导致的线粒体总量增多,MitoSOX和ROS水平的增加均随着CHK1被抑制而减少。我们还探究了抑制CHK1对卵巢癌细胞增殖的影响。我们采用EdU掺入、CCK-8及平板克隆形成实验检测在敲低RAD51的A2780细胞中进一步抑制CHK1时细胞的增殖能力,发现敲低RAD51或者单独抑制CHK1均可以导致卵巢癌细胞增殖减慢,然而,两者联合处理却没有进一步抑制细胞增殖,说明抑制CHK1可以降低氧化压力从而促进细胞存活。研究表明RAD51也存在于人类线粒体并且对于维持线粒体基因组的稳定性发挥重要作用,在氧化压力条件下,敲低RAD51可以引起mtDNA拷贝数显著减少。为了探究敲低RAD51导致的卵巢癌细胞线粒体氧化压力是否与mtDNA基因组完整性的维持有关,我们检测了卵巢癌细胞A2780敲低RAD51之后mtDNA拷贝数变化情况,发现敲低RAD51导致mtDNA拷贝数显著减少。然而,在mtDNA拷贝数基本为零的rho0细胞中敲低RAD51以后ROS、MitoSOX水平以及线粒体总量仍然显著增加。说明敲低RAD51导致的线粒体氧化压力与mtDNA的完整性无关。综上所述,我们的研究结果表明卵巢癌内RAD51表达上调,高水平的RAD51减少了细胞内DNA损伤并抑制CHK1激活,最终促进细胞存活及其恶性程度。而低水平的RAD51会抑制HRR,引发更多的DNA损伤,从而激活CHK1并导致细胞周期停滞在G2/M期,并诱导线粒体氧化压力增加,氧化压力进一步加剧细胞核DNA损伤,形成一个恶性循环的正反馈环。最终,氧化压力增加抑制了肿瘤细胞的恶性增殖。我们的结果表明某些DNA修复基因可能通过参与氧化还原稳态的维持在肿瘤发展进程中发挥促瘤作用。本研究的创新点:1.明确了RAD51在卵巢癌中表达上调并与卵巢癌患者不良预后相关。2.发现敲低RAD51导致线粒体氧化压力和氧化DNA损伤。3.发现线粒体ROS的增加需要CHK1介导的G2/M期停滞。4.发现线粒体ROS的增加与mtDNA的完整性无关。