尤因肉瘤断点区域1蛋白(Ewing sarcoma breakpoint region 1 protein,EWSR1)是TET家族成员,属于RNA结合蛋白。TET家族蛋白除了可以直接结合RNA外,TET家族蛋白还可以结合DNA,也可以作为转录辅助因子直接与转录因子结合,参与包括基因表达调控、mRNA剪切编辑、信号通路调节、DNA修复等生物学过程。研究人员最早发现EWSR1是因为在尤因肉瘤和原始神经外胚层肿瘤相关亚型中发现22号和11号染色体的断点区产生了一个杂交转录本(t(ll;22)(q24;q12))。尤因肉瘤是发生在儿童和年轻成人中的第二常见的骨肉瘤,尤因肉瘤可以发生在任何年龄,但发病高峰期是在30岁以前,约5%的成人和10-15%的儿童发生此类肉瘤,并且没有性别差异。尤因肉瘤的治疗包括化疗、放疗和手术治疗,但不幸的是,肿瘤的预后很差,大量病例伴随着原发性肿瘤和肿瘤转移。超过90%的尤因肉瘤发生EWSR1与ETS家族基因FLI1和ERG的易位。这些易位形成的融合蛋白可以靶向细胞生长、增殖、衰老、以及肿瘤发生相关的基因,从而改变细胞的命运,导致增殖异常,产生不同类型的肿瘤。因此,关于EWSR1功能的研究主要集中在其与多种转录因子易位形成融合蛋白从而参与恶性肿瘤的发生发展的过程。EWSR1定位于染色体22q12.2上,编码含656个氨基酸,包括N端的转录激活结构域和C端的RNA结合结构域,C末端最后18个氨基酸是其核定位序列。EWSR1有6个不同的转录剪切本,经实验证实的仅有2个。EWSR1在进化上高度保守的,广泛表达于大多数组织和细胞中。EWSR1主要定位于细胞核,但是也可以定位在胞浆和细胞表面。后来有研究表明EWSR1在不同的细胞类型和不同细胞时期存在动态的亚细胞定位,在细胞分裂的不同时期出现动态分布。在细胞核内,EWSR1通过与转录因子TFIID、RNA聚合酶II(RNAP II)、转录激活子或抑制子相互作用参与转录调节过程,EWSR1可以与RNA和DNA结合发挥功能。EWSR1可以直接与剪切子结合影响剪切。EWSR1还通过结合非编码RNA调节基因表达。除了核内的功能,近年来开始有研究人员关注EWSR1的其他功能。EWSR1可能抑制微管解聚,影响细胞周期进程。EWSR1缺失导致有丝分裂缺陷和纺锤体异常,细胞凋亡增加。进一步研究表明EWS/FLi1结合并抑制EWSR1功能,EWSR1影响Aurora B在分裂后期中央区的定位从而使胞质分裂失败导致非整倍体产生。然而,EWSR1参与有丝分裂进程的分子机制还不完全清楚。本研究从ewsr1特异性的时空表达模式出发,检测了ewsr1的动态定位对细胞周期的影响,并围绕着ewsr1对纺锤体微管乙酰化的动态调节开展了分子机制的研究。我们的研究表明ewsr1在m期高表达,随着m期比例的增高,ewsr1呈全细胞分布的比例也增高,提示ewsr1在m期发挥重要作用。用nocodazole处理使细胞同步化到m期后释放,流式细胞术检测表明干涉ewsr1抑制细胞离开g2/m期,间接免疫荧光实验表明,干涉ewsr1延迟细胞离开m期。我们进一步统计了m期前中期和后末期细胞的比例,发现干涉ewsr1主要延迟细胞离开m期前中期的时间。接着我们通过time-lapse实验观察发现干涉ewsr1使细胞有丝分裂时间延长,并且主要使分裂前中期时间延长,而不影响后期时长。回转ewsr1-sirna不敏感的gfp-ewsr1可以逆转细胞延迟离开g2/m期的表型,并且逆转干涉ewsr1对细胞分裂前中期的延迟作用。为了更好地了解ewsr1调控细胞有丝分裂的机制,我们采用间接免疫荧光实验确定ewsr1在细胞周期各个时相的定位。在间期,ewsr1主要定位在细胞核;当细胞核膜破裂,细胞进入分裂前期时,ewsr1呈现全细胞分布;在细胞分裂中期、后期和末期,ewsr1定位在纺锤体上。用含taxol的pem处理明确了ewsr1与纺锤体的共定位。外源gfp-ewsr1也定位在纺锤体上,干涉ewsr1后ewsr1在纺锤体上的定位消失。随后,我们用免疫共沉淀实验检测到当细胞同步化到m期时ewsr1与纺锤体微管组分α-tubulin存在相互作用,而在非同步化的细胞中不存在相互作用。gstpull-down实验表明ewsr1与α-tubulin存在直接相互作用。回转ewsr1核定位序列缺失的ewsr1-sirna不敏感的myc-ewsr1Δnls质粒能够逆转干涉ewsr1对有丝分裂的延迟作用,用rna聚合酶ii的抑制剂α-amanitin抑制细胞转录活性不影响干涉ewsr1对有丝分裂进程的影响。提示ewsr1在有丝分裂中的作用不依赖于其核内的功能。微管再生实验表明干涉ewsr1抑制纺锤体微管的形成,而冷处理实验表明干涉ewsr1使纺锤体微管更不稳定,增加了微管对冷处理的敏感。bubr1和mad2是有丝分裂检查点sac蛋白复合体的重要组分,当微管与着丝粒结合拉着染色体排列到赤道板上,并达到一定张力时,bubr1和mad2信号失活,apc/c激活,染色体分离。我们的结果表明干涉ewsr1不影响bubr1和mad2在着丝粒上的定位。并且干涉ewsr1不改变aurorab分裂前期和中期的定位,表明aurorab不参与ewsr1对有丝分裂前中期的调控。微管组分α-Tubulin K40位的乙酰化与微管稳定性有密切关系。Western Blot实验表明在细胞同步化到M期时,过表达EWSR1促进α-Tubulin的乙酰化,干涉EWSR1抑制α-Tubulin的乙酰化,但是当细胞没有做同步化处理的时候,干涉EWSR1并不影响α-Tubulin的乙酰化。间接免疫荧光实验表明,干涉EWSR1抑制细胞分裂前期和中期α-Tubulin的乙酰化,而不影响其他时期,并且排除了染色体排列异常和MG132自身对乙酰化的影响。过表达核定位序列缺失的Myc-EWSR1ΔNLS仍能促进α-Tubulin的乙酰化,而α-amanitin处理细胞后干涉EWSR1仍能够抑制α-Tubulin的乙酰化,表明EWSR1的转录活性不影响α-Tubulin的乙酰化。干涉EWSR1不影响α-Tubulin的去酪氨酸化和多聚谷氨酸化修饰。HDAC6和SIRT2是已知的α-Tubulin去乙酰化酶。用HDAC6特异性抑制剂Tubacin抑制HDAC6活性或siRNA干涉HDAC6后再干涉EWSR1对α-Tubulin的乙酰化的抑制作用减弱。干涉SIRT2再干涉EWSR1仍能够抑制α-Tubulin的乙酰化,表明EWSR1通过HDAC6影响α-Tubulin的乙酰化而非SIRT2。Tubacin抑制HDAC6活性可以逆转干涉EWSR1对有丝分裂染色体排列异常和多极纺锤体的影响。免疫共沉淀表明EWSR1可能通过抑制HDAC6在纺锤体微管上的结合从而促进α-Tubulin的乙酰化。综上所述,我们的研究提示EWSR1在有丝分裂进程和纺锤体动态性调控中发挥重要作用,EWSR1通过HDAC6影响微管乙酰化,改变纺锤体动态性,从而影响有丝分裂进程。我们的研究进一步明确了EWSR1在有丝分裂进程中的作用,为靶向有丝分裂的肿瘤药物研发提供新的思路。