精细追踪特定细胞类型神经元的输入和投射网络对于理解脑在正常及病理状态如何行使功能是极其必要的。过去的数十年里,以重组腺相关病毒（Recombinant Adeno-associated Viruses,rAAVs）为代表的病毒工具广泛用于神经环路的追踪。然而,由于神经网络极其复杂以及rAAVs基因组包装容量有限（通常小于4.7 kb）,通常需要两个或更多的rAAVs携带不同基因片段来实现神经环路中多基因共同表达的需求。尽管多rAAVs介导的标记系统在解析神经环路上已取得重大进步,但仍然面临一些缺陷,比如:跨突触追踪效率不够高以及在稀疏标记时,神经元标记亮度不够高、在不同实验个体或不同Cre表达鼠系中标记稳定性不够高等。为了解决这些问题,当前通用的策略主要是对r AAV的基因组进行改造。然而,这些方法仍不能解决如在远离注射位点和本身输入强度较弱的脑区跨突触追踪效率非常低等问题,因此严重阻碍了对神经网络进一步的解析。本文开发了一系列基于质粒混合策略（共包装）的重组酶依赖的新型r AAV系统,实现了对神经环路高效超亮的标记,并应用于追踪和重建特定类型神经元的输入和输出网络。本文的主要内容可概括为:（1）通过对两个相同血清型、仅表达不同荧光蛋白的rAAVs在鼠脑中表达水平的定性定量比较,发现两者之间存在相互排斥的现象;并进一步发现基于质粒混合的rAAVs可以显著降低这种排斥作用,并增强多个基因在同一细胞协同表达的效应。（2）基于质粒混合策略,发展了用于精细解析单个神经元投射组的非特异性（系统I）和特异性（系统II）超亮神经元标记系统,分别实现了超过病毒分别包装后混合的策略5倍和10倍以上的标记亮度。结合于全脑成像系统,使用系统I发现了一类初级运动皮层独有的、新的投射类型的神经元;使用系统II对单个基底前脑胆碱能神经元在突触结水平上进行完整形态的重建,所得到的单个神经元轴突分支和突触结数目均是以前研究报道的10倍左右。（3）基于质粒混合策略,发展了增强型的单突触系统（系统III）用于高效追踪特定类型神经元全脑范围内输入网络。较之于两个rAAVs辅助病毒分别包装后混合的策略所介导的单突触系统,实现了全脑范围内各脑区追踪效率的提高,以及对超过三分之一的（40%）、以前方法标记稀少的脑区10倍以上效率的提高。本文发展得到的基于质粒混合策略的重组酶依赖的新型r AAV系统,将不仅为全面解析神经网络中输入和输出的环路提供强有力的工具,而且为简单高效进行神经环路功能研究提供新的思路,同时有望提高基因治疗中多基因协同表达的效率以及减少过量基因表达对机体造成损伤。