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目的肺癌是全球范围内发病率和死亡率高居第一位的恶性肿瘤。细胞生物学行为的改变是肺癌发生和发展的重要原因。TC-1蛋白在多种肿瘤组织中异常高表达,并且与肿瘤的细胞生物学行为密切相关,但是,其在肺癌中的作用尚不明确。本课题旨在研究TC-1在非小细胞肺癌中的表达及其与非小细胞肺癌细胞生物学行为的相关性,并探寻其作用机制,为肺癌的研究提供新靶点,开辟新途径。方法(1)收集122例临床非小细胞肺癌病人的癌组织标本及相应的正常肺组织,以及临床病理信息。应用免疫组化技术检测TC-1及Ki-67在肺癌组织及相应正常肺组织中的表达。分析肺癌组织与正常肺组织间TC-1表达的差异;按年龄、性别、病理类型、TNM分期、区域淋巴结转移及细胞增殖状态进行分组,分析TC-1表达与上述临床病理特征的关系。(2)体外构建人TC-1过度表达慢病毒及人TC-1干扰表达慢病毒,并分别转染NCI-H520细胞及A549细胞,通过筛选建立稳定的TC-1过度表达细胞及TC-1干扰表达细胞。为进一步研究TC-1对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响:①采用MTT、平板克隆形成实验检测TC-1对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响;②采用流式细胞技术检测TC-1对非小细胞肺癌细胞周期的影响;③采用流式细胞技术检测TC-1对非小细胞肺癌细胞凋亡能力的影响;④采用transwell小室迁移实验检测TC-1对非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响;⑤采用transwell小室侵袭实验检测TC-1对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响;⑥采用体内成瘤实验以及免疫组化技术检测TC-1对非小细胞肺癌细胞体内增殖能力的影响。(3)采用FGFR2信号通路抑制剂PD173074阻断A549细胞及NCI-H520-pLenti-TC-1细胞的FGFR2信号通路,采用荧光定量PCR及WesternBlotting技术检测TC-1的表达。为进一步研究阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响:①采用MTT、平板克隆形成实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响;②采用流式细胞技术检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞周期的影响;③采用流式细胞技术检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞凋亡能力的影响;④采用transwell小室迁移实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响;⑤采用transwell小室侵袭实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响;⑥采用体内FGFR2信号通路分析实验检测阻断FGFR2信号通路对非小细胞肺癌细胞体内增殖能力及化疗敏感性的影响。(4)采用Western Blotting技术检测A549,A549-pLenti-shRNA1及NCI-H520,NCI-H520-pLenti-TC-1细胞中Wnt/β-catenin信号通路下游分子(CCND1、c-Myc、c-Met)及Caspase-3的表达。结果(1)免疫组化分析结果显示:TC-1在肺癌组织中的表达主要定位于阳性细胞细胞质内,呈局灶性或弥漫性表达,其表达率为73.77%(90/122);在支气管肺泡上皮细胞中呈低表达或阴性表达;TC-1表达在不同性别、年龄以及病理类型之间无明显统计差异(P>0.05),但与TNM分期以及区域淋巴结转移密切相关(P<0.05)。在TNM分期中,I期患者TC-1的阳性表达率为47.62%(10/21),II其患者TC-1表达阳性率为72.34%(34/47),III期患者阳性表达率为85.19%(46/54)。TC-1在N0患者中的阳性表达率为46.15%(12/26),在N1患者中的阳性表达率为73.47%(36/49),在N2患者中的阳性表达率为89.36%(42/47)。以Ki阳性指数将患者分为高增殖组(Ki-67labelling index>10%)和低增殖组(Ki-67labelling inde≤10%),在高增殖组中,TC-1阳性表达率为95.29%(81/85),在低增殖组中,TC-1阳性表达率为24.32%(9/37),两组之间统计学差异明显(P<0.05)。实验结果提示:TC-1在非小细胞肺癌组织中异常高表达,其表达与性别、年龄、病理类型无关,与TNM分期、区域淋巴结转移以及增殖状况密切相关。(2)为了研究TC-1在非小细胞肺癌中的生物学功能。首先,采用RT-PCR及Western Blotting技术检测TC-1基因及其蛋白在非小细胞肺癌细胞A549、SPC-A-1、95D及NCI-H520中的表达,正常支气管粘膜上皮细胞16HBE被用作对照组。RT-PCR及Western Blotting结果显示:TC-1在A549、SPC-A-1、95D细胞中的表达高于在16HBE细胞中的表达,在NCI-H520中的表达低于在16HBE细胞中的表达。基于A549是TC-1表达量最高的细胞,NCI-H520细胞是TC-1表达量最低的细胞这一结果,选择A549细胞及NCI-H520细胞作为后续研究细胞系。接着,用干扰表达慢病毒转染A549细胞,用过度表达慢病毒转染NCI-H520细胞,分别使用流式细胞技术及杀稻瘟素筛选后,RT-PCR及Western Blotting技术检测筛选后细胞中TC-1的表达水平,结果显示:目的病毒转染后的细胞较对照组细胞,TC-1的表达明显下降或明显上调,而对照病毒未能改变TC-1的表达。最后,采用一系列体内外功能学实验检测TC-1表达与非小细胞肺癌细胞生物学行为的关系。结果显示:与对照组细胞对比,A549-pLenti-shRNA1细胞的增殖、周期转换、凋亡抵抗、迁移及侵袭等能力明显减弱,各组之间有显著统计学差异(P<0.05),而NCI-H520-pLenti-TC-1细胞的增殖、周期转换、凋亡抵抗、迁移及侵袭等能力明显增强,各组之间统计学差异显著(P<0.05)。(3)向培养于SITA培养液中的A549和NCI-H520-pLenti-TC-1细胞加入PD137074用于研究FGFR2信号通路是否调节TC-1的表达,RT-PCR及Western Blotting检测结果显示:经过PD173074处理过的细胞,其TC-1的表达明显下降,而内对照组,只加入相同体积DMSO未能改变TC-1的表达。为进一步研究抑制FGFR2信号通路对TC-1诱导的细胞生物学行为的作用,一系列体外功能学实验及体内通路分析实验被用于研究。功能学实验结果显示:与对照组细胞相比,PD173074处理过的A549细胞和NCI-H520-pLenti-TC-1细胞,其体外增殖、周期转换、凋亡、迁移、侵袭等能力明显减弱,各组之间有显著统计学差异(P<0.05);体内通路分析实验结果显示:与空白对照组相比,PD173074组、顺铂组、PD173074联合顺铂组明显抑制细胞增殖,延长裸鼠荷瘤生存时间,尤其是PD173074联合顺铂组,其作用效果最为明显。(4)采用Western Blotting技术研究TC-1调节非小细胞肺癌细胞生物学行为的下游信号分子,结果显示:相比于A549细胞,A549-pLenti-shRNA1细胞中CCND1、c-Myc及c-Met的表达水平明显下调,而Caspase-3的表达明显上调;相对于NCI-H520细胞,NCI-H520-pLenti-TC-1细胞中CCND1、c-Myc及c-Met的表达水平明显上调,而Caspase-3的表达明显下调。结论(1)TC-1在非小细胞肺癌中异常高表达,其表达与TNM分期、区域淋巴结转移、增殖密切相关,而与年龄、性别、病理类型之间无明显相关。(2)成功构建了稳定TC-1干扰表达的肺癌细胞系A549-pLenti-shRNA1和稳定TC-1过度表达的肺癌细胞系NCI-H520-pLenti-TC-1。TC-1的表达在体内、体外均影响非小细胞肺癌细胞增殖、周期、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为。(3)在非小细胞肺癌中,TC-1是FGFR2信号通路的下游分子,PD173074阻断FGFR2信号通路,可以抑制TC-1的表达,进而抑制TC-1所调控的细胞生物学行为。(4)证实TC-1通过诱导wnt/β-catenin信号通路下游信号分子的表达及抑制Caspase-3的表达来调控细胞的生物学行为。本实验系统的研究了TC-1在非小细胞中的表达以及其在非小细胞肺癌细胞生物学行为中的作用,证明了TC-1是FGFR2信号通路的下游信号分子,Wnt/β-catenin信号通路及Caspase-3的上游信号分子,共同参与调控非小细胞肺癌细胞的生物学行为。为肺癌的研究提供了新的靶点,开辟了新途径。