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光保护机制是植物针对强光对光合作用的光抑制甚至光破坏所进化出的一系列适应机制,主要包括依赖叶黄素循环的热耗散机制和光系统Ⅱ(PSⅡ)关键组份D1蛋白周转机制等。叶黄素循环中关键酶紫黄质脱环氧化物酶(violaxanthin de-epoxidase,VDE)定位于类囊体腔内,其活性依赖二硫键的形成。最近研究表明拟南芥类囊体膜上的维生素K环氧化物还原酶(Vitamin K epoxide reductase,VKOR)参与二硫键的形成,且氧化还原活性对PSⅡ的组装是必需的。VKOR是否参与调节叶黄素循环及D1蛋白周转,这对于深入阐明植物光保护机制具有重要的理论意义。本实验以野生型(WT)、VKOR缺失突变体(vkor-2)和转基因补偿型(vkor-2C)拟南芥为实验材料,通过使用二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)调控VDE的活性从而影响叶黄素循环,硫酸链霉素(Streptomycin sulphite,SM)抑制叶绿体编码蛋白质合成从而调控D1蛋白周转,研究不同光强条件下VKOR基因的表达与叶黄素循环及D1蛋白周转两个光保护途径的关系,主要研究结果如下: (1)VKOR缺失影响PSⅡ反应中心的活性,加重光抑制。最大光化学效率(Fv/Fm)和实际光化学效率(ΦPSⅡ)能够反映PSⅡ反应中心的活性,在正常生长光(120μmol·m-2·s-1)条件下,野生型(WT)叶片的Fv/Fm为0.81±0.04左右,然而VKOR缺失突变体(vkor-2)叶片的Fv/Fm为0.53±0.03左右;强光(1000μmol·m-2·s-1)导致最大光化学效率下降,vkor-2突变体叶片的Fv/Fm下降幅度比野生型大。ΦPSⅡ与Fv/Fm的趋势是一致的。转基因补偿型(vkor-2C)与WT的变化趋势相似,以上实验结果表明VKOR的缺失导致PSⅡ反应中心活性受到严重的伤害,光抑制增强。 (2) VKOR缺失影响依赖于叶黄素循环的热耗散。在强光胁迫条件下,高等植物能够以一种有效的非光化学猝灭(nonphochemical fluorescence quenching,NPQ)的方式将过剩光能以热能的形式耗散掉,从而保护光合机构免遭光破坏。NPQ是一种重要的激发能耗散机制,它需要叶黄素循环的参与。强光(1000μmol·m-2·s-1)照射后,vkor-2突变体叶片的NPQ比WT叶片的低。DTT处理抑制叶黄素循环后,导致NPQ大幅度下降,且WT叶片的NPQ下降幅度比vkor-2突变体大,vkor-2C植株的变化与WT相似。实验结果表明,VKOR缺失抑制叶黄素循环,从而影响依赖于叶黄素循环的热耗散。 (3) VKOR调控VDE的氧化还原状态从而影响叶黄素循环介导的热耗散。叶黄素循环中脱环氧化组份玉米黄质(Zeaxanthin,Zea)直接参与热耗散,而Zea是紫黄质(Violaxanthin,Vio)通过VDE的催化作用脱环氧化经花药黄质(Antheraxanthin,Ant)生成的。为了进一步确定VKOR是否调控VDE的活性,检测了叶黄素循环中Vio、Ant和Zea各组份的变化,计算出叶黄素循环中色素的脱环氧化程度(de-epoxidation index,DEI),用于反映叶黄素循环状态及VDE酶的活性。在1000μmol·m-2·s-1强光胁迫下,未经DTT处理,vkor-2突变体叶片的DEI比WT及vkor-2C叶片的低;DTT处理后,vkor-2突变体叶片的DEI下降幅度比WT及vkor-2C小。结果表明VKOR缺失影响了叶黄素循环中VDE的活性,导致叶黄素循环介导的热耗散能力降低。 (4)强光条件下VKOR缺失加快了D1蛋白的降解,从而影响D1蛋白周转途径。通过D1蛋白周转可部分恢复强光胁迫引起的PSⅡ反应中心的失活,从而保护光合机构。SM处理可抑制D1蛋白合成,在正常生长光或强光下,SM处理使vkor-2突变体叶片的Fv/Fm下降幅度比WT和vkor-2C大,暗示着vkor-2突变体叶片的D1蛋白降解比WT的多,导致失活的PSⅡ反应中心不能及时得到修复。Western-Blotting进一步分析表明,在正常生长光下,未经SM处理,vkor-2突变体中D1蛋白的含量仅为WT一半;SM处理后,强光诱导了PSⅡ反应中心D1蛋白快速降解,导致D1蛋白的含量降低。与WT和vkor-2C植株相比,vkor-2突变体中D1蛋白含量显著降低,仅有痕量,D1蛋白的含量远远不足WT和vkor-2C的一半。