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干旱是人类面临的主要自然灾害,它影响植物生长和发育,从而使各种经济作物产量严重下降,是影响植物生长发育的最主要逆境因子之一。火龙果(Hylocereus undatus)在经济和生态上都有很高的价值,是近年来广泛关注的一种新兴热带亚热带果树,已成为贵州省喀斯特高温干旱地区正在开发的新、特、优农业项目。实验室已有研究表明,火龙果的抗旱基因资源尤其丰富。开展火龙果抗旱基因资源的挖掘,对于火龙果种质资源的保护和种质创新具有重要意义。本文以火龙果为材料,进行了抗旱相关MYB基因的克隆及其表达特性研究,主要结果如下: 1、RT-PCR克隆了火龙果泛素(UQT)基因和核糖体RNA基因(18s rRNA),其表达分析结果表明,此2基因表达稳定,表达量几乎不受外界因素的诱导,可作为内参基因研究火龙果逆境胁迫下基因的表达分析,分别将其命名为 HuUQT和Hu18s rRNA。 2、在Microarray数据的基础上,采用RT-PCR方法克隆了火龙果参与抗旱胁迫相关MYB基因片段(408 bp),命名为HuMYB。该基因编码的氨基酸与梅花(Prunus mume)PmMYB的相似性最高(64%)。 3、半定量 RT-PCR和荧光定量 PCR分析火龙果HuMYB在胁迫中的表达特性。研究表明,HuMYB的表达受干旱胁迫和低温胁迫的影响,在同种胁迫条件不同胁迫时间下的基因表达量存在差异。随着处理时间的增长,HuMYB在两种胁迫中的表达量均较 CK降低,在干旱胁迫下呈“上升-下降-上升-下降”的表达趋势,且在24 h和7 d表达最高,在20 d表达最低。而在低温胁迫下的表达持续降低,在两个火龙果种质(白肉品种和红肉品种)的表达均在48 h时明显降低,且在紫红龙中的表达量降低较明显。 4、采用荧光定量PCR技术,分析HuMYB、bHLH和GR在同一个干旱胁迫点不同种质中的表达特性。结果表明,这3个基因在5个种质(红龙果、红龙、B7、B4及紫红龙)中的表达均存在明显差异。HuMYB、bHLH在紫红龙中表达最高,在红龙中表达最低;GR在 B中表达最高,在红龙果、红龙、B7和紫红龙中表达无明显差异。从整体来看,三个基因之间,在火龙果种质中表达量最高的是GR,其次是HuMYB,表达量最低的是bHLH。三个基因在紫红龙中表达相对较高。 5、Real-time PCR分析结果表明了HuMYB与HuMYC在果实中表达存在明显差异,HuMYB的表达量随发育时间的增加而增加,且HuMYB在红肉20 d的表达水平最高,在白肉5 d中的表达水平最低;而HuMYC随白肉果实发育时间的增加而降低,随红肉果实发育时间的增加而降低,且在白肉20 d中表达最高,在红肉20 d中表达最低。 6、采用RACE克隆技术克隆HuMYB的全长,得到共2345 bp的基因全长序列,该基因完整开放阅读框ORF(Open Reading Frame)为1371 bp,编码456个氨基酸,分子量为52.9 kDa,理论等电点(PI)为6.4,为亲水性蛋白质,HuMYB蛋白的二级结构中占主导地位的是无规则卷曲。