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【研究背景】脓毒症（ sepsis）是一种感染所致的全身炎症反应综合征（SIRS），由于容易合并多器官衰竭（MOF），病死率高，是重症监护病房（ICU）非心血管疾病的主要死亡原因之一。脓毒症的病理生理机制异常复杂，主要涉及炎症的激活、内皮细胞损伤、微循环障碍、凝血功能障碍、免疫抑制、细胞凋亡、基因多态性、神经-内分泌-免疫调控紊乱等一系列问题，但具体机制仍不明确。新近的研究表明，细胞自噬（autophagy）也参与了脓毒症的发病，细胞自噬在脓毒症中被激活，通过维持细胞内平衡、限制细胞损伤和死亡而起保护作用。然而，当细胞自噬过度激活时，不一定对病原体感染的细胞起保护作用，既往细胞实验已证实，自噬机制会为入侵的细菌最初的存活和繁殖提供条件。但是细胞自噬在脓毒症中所起的作用仍不明确，有待进一步探索。微小核糖核酸（miRNAs）也参与了免疫细胞功能和细胞自噬的调控。有研究表明选用脂多糖（LPS）在体外刺激巨噬细胞，巨噬细胞的应答是通过调控miRNAs中的let-7e、miR-181c、miR-155和miR-125b的表达而完成的。研究表明体外培养的肺泡巨噬细胞株受LPS刺激后，miR-146a在巨噬细胞株中表达增高。前期研究也证实，miR-129和miR-142-3p参与调控THP-1细胞的炎症/自噬水平。通过生物信息学软件比对，筛选出miR-101和miR-125a-5p，这两个miRNAs可能靶向作用于自噬相关基因4D（ATG4D），而后者是自噬过程中的一个重要分子。因此，通过体外培养THP-1细胞，经PMA诱导分化为THP-1巨噬细胞后，用LPS刺激THP-1巨噬细胞建立细胞模型，采用转染的方法在细胞内过表达miR-101和miR-125a-5p，检测相应的自噬相关蛋白表达变化，探讨这两个miRNAs对LPS诱导的细胞自噬的调控作用。 【研究目的】证明miR-101、miR-125a-5p对LPS诱导的免疫细胞自噬过程中的调控作用。 【研究方法】 1. THP-1细胞的复苏、培养、传代、冻存，以及THP-1巨噬细胞的诱导。 2.采用不同浓度（0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml）LPS处理THP-1巨噬细胞12小时后，利用MTS细胞增殖实验检测细胞活力水平，利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清液中TNF-α、MCP-1水平，利用蛋白免疫印记技术（ Western blot）检测自噬相关蛋白( LC3II、Beclin1、ATG4D)的表达变化。 3.采用LPS500ng/ml处理THP-1巨噬细胞12小时后，通过定量PCR检测miR-101、miR-125a-5p表达的情况。 4.转染试剂脂质体 lipofectamine RNAiMAX介导 miRNA模拟物（miRNA-mimic）转染THP-1巨噬细胞，转染4小时后，通过荧光显微镜检测miRNA-mimic的转染效率。 5.转染THP-1巨噬细胞24小时后，LPS500ng/ml处理THP-1巨噬细胞12小时后，利用蛋白免疫印记技术（Western blot）检测自噬相关蛋白( LC3II、Beclin1、ATG4D)的表达变化情况。 【结果】 1. LPS刺激THP-1巨噬细胞后炎症因子的释放情况：LPS刺激THP-1巨噬细胞12小时后TNF-α、MCP-1释放水平较空白对照组均显著上升。 2. LPS刺激THP-1巨噬细胞后自噬相关蛋白的变化：LPS刺激THP-1巨噬细胞12小时后，LC3II、Beclin1、ATG4D表达均上调，细胞自噬增强，LPS浓度为500 ng/ml时，效果最明显。 3. LPS刺激THP-1巨噬细胞后相关miRNAs变化情况：LPS刺激THP-1巨噬细胞12小时后，miR-101、miR-125a-5p较空白对照组表达均显著下降。 4.过表达miR-101、miR-125a-5p对LC3II、Beclin1、ATG4D蛋白水平的影响：在细胞内分别过表达miR-101、miR-125a-5p后，LC3II、ATG4D和Beclin1蛋白表达下调；同时过表达miR-125a-5p和miR-101两个miRNAs时，LC3II、ATG4D的表达下调更为显著。 【结论】 1.经PMA诱导的THP-1巨噬细胞，受LPS刺激后自噬水平发生上调； 2. miR-101、miR-125a-5p能够抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞自噬，其机制可能是通过靶向抑制ATG4D的表达来实现。