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促性腺激素抑制激素(GnIH)是动物下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic–pituitary–gonadal,HPG)中的下丘脑抑制激素,通过抑制Gn RH调控动物繁殖。GnIH是由十二个氨基酸组成的短肽,它通过直接或间接作用于Gn RH神经元,可降低动物机体内促性腺激素等生殖激素的分泌;同时,GnIH在性腺中也可通过自分泌/旁分泌方式调控动物的性腺机能。本研究以GnIH为靶基因构建pt S2GnIH-asd双拷贝重组质粒,在细胞水平检测重组质粒pt S2GnIH-asd的转录及表达,用构建的质粒免疫湖羊母羔,检测血清中抗体滴度水平及相关激素水平,观察母羔卵巢组织微观结构及公羊对母羔的性行为,评估GnIH基因疫苗在湖羊母羔上的免疫效果。(1)重组表达质粒pt S2GnIH-asd的构建与鉴定化学合成2对互补的GnIH基因单链核苷酸片段,通过PCR聚合获得尾端和中端GnIH目的片段,尾端GnIH片段替换p VAX-S-Gn RH-asd载体中的Gn RH基因,构建p SGnIH-asd单拷贝重组表达质粒;将中端GnIH片段插入p SGnIH-asd重组质粒中HBs Ag-S基因编码的第112至113个氨基酸密码子之间,构建p S2GnIH-asd双拷贝质粒;将含有酶切位点的t PA基因连接至p S2GnIH-asd质粒中HBs Ag-S基因的5’端,构建pt S2GnIH-asd重组表达质粒,融合目的基因记为t S2GnIH,各重组质粒经酶切、测序,其目的基因序列、插入位点及方向均正确。无内毒素提取重组表达质粒pt S2GnIH-asd及空质粒p VAX-asd,以脂质体包裹的方法转染Hela细胞,24 h后通过RT-PCR成功检测到融合基因t S2GnIH的转录;48 h后利用Western blot方法检测到融合蛋白t S2GnIH的正常表达,大小约30.91 k Da,表明在真核细胞中pt S2GnIH-asd质粒可正常进行转录和表达。(2)GnIH基因疫苗免疫湖羊母羔及免疫效果评估选取56日龄健康湖羊母羔10头,随机分为2组,疫苗组注射pt S2GnIH-asd质粒,对照组注射p VAX-asd空质粒。每组分别免疫注射3次,每次间隔21 d。初次免疫(第0 d)至第98 d期间,每14 d采血和称重,第98 d屠宰并采集组织。实验过程中母羔生长状况良好,两组母羔体重之间没有显著差异(P>0.05);用Elisa检测血清抗体滴度,发现在第14 d至98 d时疫苗组母羔血清中均检测到抗GnIH抗体(P<0.05);对照组LH和E2水平在整个实验期稳定,而疫苗组LH和E2水平逐步上升,在第70 d至98 d时显著高于对照组(P<0.05);疫苗组血清中FSH和孕酮(P)与对照组相比没有显著差异(P>0.05);疫苗组卵巢中大卵泡数显著高于对照组(P<0.05);试情公羊对疫苗组持续嗅闻和追逐次数显著高于对照组(P<0.05)。