创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)是一个世界性的公共卫生问题。TBI不仅具有较高的患病率和致死率,而且是继发性癫痫发病的一个重要原因,严重影响患者的生活质量。在我国,TBI是40岁以下成年人创伤性死亡的主要原因。即使有幸存活下来一部分TBI也将造成严重的神经功能缺失和行为能力的障碍,给家庭和社会造成极大的负担。目前临床主要采用对症支持疗法,另外采用积极的院前复苏、快速分流、重症监护也有助于降低死亡率,但这些治疗方法仍不能达到令人满意的效果。TBI在病理生理学上可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤两个阶段。首先原发性的机械性创伤会对局部的神经组织造成损害,而损伤本身随后又会触发一连串的级联反应,包括神经组织缺血、继发于弥漫性轴索损伤的Wallerian变性、兴奋毒性、钙稳态失调、线粒体功能障碍和自由基介导的损伤等。继发性的脑损伤常发生在头部受伤后的数小时到数天的时间内。而且TBI之后神经元的丧失不仅仅发生在损伤局部而且可以弥散到其它脑区。局灶性损伤典型的特征是损伤区周围的灰质内或灰白质交界处的出血。这种局灶性的神经元死亡有两种机制,迅速的细胞坏死和进程较慢的细胞调亡。弥漫性损伤则主要发生在海马区神经元,海马区的神经元对TBI的反应尤为敏感,在所有致命的TBI患者中有超过80%存在海马区神经元的大量丧失,即使在没有颅高压存在的情况下亦是如此。这造成的直接后果便是导致实验动物或患者记忆和认知功能的损害。当前对TBI治疗方法的研究主要基于以上对继发性脑损伤的病理生理、分子和细胞机制的认识,包括占位性病变的早期发现和清除防止二次损伤,并尝试通过药物来减轻生化和细胞级联反应造成的损害。人们普遍认为,成年人在损伤后刺激中枢神经系统再生将可能需要一个或多个以下的进程：细胞更换、提供神经营养因子、促进轴突导向和去除抑制轴突生长的因素、细胞内信号传导的调控、桥接和材料、和/或调节的免疫反应。自从20年前哺乳动物大脑的神经元和星形胶质细胞具有自我更新的能力被证实以来,对中枢神经系统损伤的研究热点逐渐转入对神经生物学的研究,例如细胞替代疗法已经成为研究和商业活动的一大焦点。越来越多的证据表明,基手干细胞移植的治疗方法可能是用于治疗TBI后功能障碍的最有前途的治疗策略之一。细胞替代疗法以如下的治疗理念为基础,即创伤或疾病所引起的神经功能缺失可以通过引入新的细胞来替代丧失的神经元和胶质细胞,或者所引进细胞通过神经营养作用来增加受损的神经细胞的存活、可塑性和功能的恢复来发挥作用。迄今为止各种类型的干细胞,包括胚胎干细胞,神经干细胞和间充质干细胞目前正在被用于移植研究来治疗中枢神经系统损伤。胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)移植对大鼠的脑损伤功能恢复有治疗作用,但是移植后的肿瘤形成限制了它在人体当中的应用。另外胚胎干细胞的应用存在明显道德伦理障碍和胎儿组织来源不足等问题。最新的研究显示诱导多能干细胞induced pluripotent stem cells, iPS)具有ESC的全能性,但是它同样存在体内形成肿瘤的危险。神经干细胞(Neural stem cells, NSC)是一个用来移植治疗脑损伤理想的种子细胞,它既可以分化成神经细胞又可以分泌多种神经营养因子,但是大量神经干细胞的来源问题目前为止仍然限制了它的应用。人间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)被认为是一个很好作为脑损伤移植治疗的备选细胞。在实验和临床研究中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSC)是目前使用最广泛的种子细胞。然而抽取骨髓是一个具有高度侵入性的过程中,存在疼痛和感染的风险,而且其分化的潜能和扩增能力都会随着年龄的增加而降低。因此寻找BM-MSC的替代细胞已经成为一个研究方向。来自胎盘,胎膜,羊水或胎儿组织细胞在细胞数量、扩张潜力和分化能力上都较成体组织来源的间充质干细胞更高。而且它们当中的一些细胞已经被用来研究治疗神经退行性疾病和神经创伤性疾病。尽管胎盘来源的某些间充质干细胞已经被用末研究其对实验动物某些神经系统疾病模型的治疗作用,但是目前仍不清楚围生期组织来源的各种细胞对神经系统疾病的治疗作用是否相同。在本研究中,我们将重点比较人羊膜来源间充质干细胞(amniotic membrane mesenchymal stem cells, AM-MSC)和脐带华通胶来源的间充质干细胞(umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSC)的生物学特性,比较它们的形态、体外扩增能力、免疫表型、和多能性。鉴于神经干细胞是用来移植治疗TBI一个最理想的种子细胞,我们还比较了这两种间充质干细胞的体外神经分化潜能,哪种细胞越容易的分化成神经干细胞,它就越适合作为治疗TBI的种子细胞。细胞移植治疗TBI,除了细胞替代以外,移植细胞提供的旁分泌功能也起到一定的作用。MSC被移植到脑损伤区域后可以提高损伤局部的神经营养因子浓度,这对受损细胞的存活和分化具有重要的意义。本实验中我们使用人细胞因子抗体芯片检测两种来源间充质干细胞的507个细胞因子的表达。同时在两种间充质干细胞的神经干的诱导过程中,我们在体外检测了对神经系统发育和重建具有关键作用的5个神经营养因子。它们是脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、神经营养因子3(neurotrophin3, NT-3)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor, GDNF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)。这一结果将在一定程度上对于TBI损伤修复中种子细胞的选择提供-定的参考,尤其是在神经营养因子分泌方面。同时这也反映神经干细胞诱导过程对不同细胞分泌神经营养因子能力的影响。另一方面移植入体内干细胞的存活能力也是干细胞移植治疗需要考虑的重要方面。间充质干细胞的移植治疗效果往往被植入细胞的大量损失所限制,细胞的死亡是由于损伤部位的恶劣微环境所引发。本研究中我们通过过氧化氢和去血清培养两种方式来模拟过氧化应激和局部的缺血缺氧环境,并比较了两种来源间充质干细胞体外的抗凋亡能力。抗凋亡能力强的干细胞更适合体内移植治疗TBI.本研究包括三个部分：第一部分AM-MSC和WJ-MSC的分离、培养和鉴定目的：建立一种简单有效的分离培养AM-MSC和WJ-MSC的方法,观察其形态,检测其表面抗原标记的表达情况,观察培养过程中核型的变化,比较两种细胞体外增殖能力,观察其表面的细微结构,并检测它们中胚层多向分化能力。方法：对与羊膜细胞的分离我们采用2.4U/mL中性蛋白酶、1.0mg/mL胶原酶A和0.01mg/mL脱氧核糖核酸酶依次消化来分离；对于华通胶细胞的分离我们采用Ⅱ型胶原酶和0.125%胰酶/EDTA依次消化的方法来分离。通过光学显微镜对细胞进行形态学观察,并通过原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)对细胞表面的细微结构进行扫描。运用流式细胞术对两种分离得到的细胞的表面抗原进行检测,并通过免疫细胞化学的方法对其表达神经干细胞标志的情况进行检测。通过测定体外累积群体倍增来对两种细胞体外增殖能力进行比较,并对体外培养的细胞进行核型分析。我们对两种MSC的中胚层多向分化能力进行的检测,包括向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化能力。结果：通过上述的方法我们成功的分离培养出AM-MSC和WJ-MSC.两种细胞都呈现成纤维细胞样贴壁生长,相比之下WJ-MSC形态更加细长并具有更加强的折光性。对细胞表面抗原检测,我们发现两种细胞的表达情况相类似,它们表达间充质干细胞的表面抗原(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105),不表达血液和内皮系统的表面抗原(CD19、CD31、CD34和CD45),表达Ⅰ类抗原HLA-ABC但不表达Ⅱ类抗原HLA-DR。通过对两种细胞向中胚层多向分化能力的检测,发现两种细胞都能够向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞方向分化。以上结果与国际细胞治疗学会对间充质干细胞的定义和标准相符合,这说明我们从上述组织中分离出的细胞符合间充质干细胞的特性。免疫细胞化学检测结果显示两种细胞都强烈表达波形蛋白(100.00±0.00%vs.100.00±0.00%),少量的AM-MSC和WJ-MSC表达nestin (28.73±2.97%vs.19.22±2.96%, t=2265, P=0.053)±sox2(20.58±2.43%vs.21.11±2.51%,t=0.154, P=0.881)和Musashil (10.17±3.10%vs.12.62±2.58%,t=0.609,P=0.559),两组之间nestin在AM-MSC中阳性率较高但差异无统计学意义。AFM扫描结果显示,AM-MSC具有更强的粘附能力,在细胞的生长过程中边缘胞体有更长的伪足伸出,这提示其可能具有更强的迁移能力。体外扩增实验结果显示,WJ-MSC具有更高的体外增殖能力(F=817.948,P<0.001)。在细胞培养的各个阶段我们都对细胞进行了核型分析,未发现体外培养对其正常核型的产生影响。结论：我们成功分离出AM-MSC和WJ-MSC,分离出的细胞符合MSC的标准,包括表面抗原的表达情况和中胚层多向分化的能力。AM-MSC具有更强的粘附能力,并可能有更强的体内迁移能力；而WJ-MSC则具有更强的体外增殖能力。两种细胞在体外培养条件下都能保持正常的二倍体核型。第二部分AM-MSC和WJ-MSC向神经干细胞分化能力的比较目的：建立一种诱导AM-MSC和WJ-MSC分化为神经干细胞的方法。通过这种方法我们想找到神经干细胞的新的来源,另外我们比较两种来源间充质干细胞向神经干细胞的分化能力。检测在诱导过程中神经营养因子表达量的变化情况。方法：间充质干细胞向神经干细胞分化的方法如下：AM-MSC和WJ-MSC培养在神经干细胞诱导培养基中,培养基含有KnockOutTM DMEM/F-12基础培养基、20ng/mL人上皮细胞生长因子(human epidermal growth factor, EGF)、20ng/mL人成纤维细胞细胞生长因子(human beta fibroblastic growth factor, bFGF)、神经干细胞添加剂StemPro(?) NSC SFM和GlutaMAXTM-Ⅰ添加剂(1：100)同时含有1%的青链霉素,在37℃和5%CO2置于25cm2超低粘附力表面的培养瓶中。每3天更换一次新鲜培养基。诱导10天后,收集神经球通过实时定量PCR和酶联免疫吸(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)附实验来检测神经营养因子的表达水平。结果：AM-MSC和WJ-MSC可以被诱导成神经球(一种神经干细胞的生长方式),羊膜来源的神经干细胞(amnion derived neural stem cells,AM-NSC)和脐带华通胶来源的神经干细胞(umbilical cord Warton’s jelly derived neural stem cells,AM-NSC).而且这种诱导得到的神经球具有神经干细胞的大部分特征。免疫细胞化学结果显示AM-MSC和WJ-MSC经过诱导之后表达三种神经干细胞的标志。经过神经干细胞诱导培养基诱导之后与未诱导的间充质干细胞相比,神经干细胞的标志表达明显上调。细胞免疫化学具体结果如下：AM-NSC与AM-MSC相比表现更强的nestin.sox2和musashi荧光信号(nestin,92.05±2.75%vs.28.73±2.97%,P<0.001；sox2,70.17±3.16%vs.20.58±2.43%,P<0.001； Musashil,66.94±3.62%vs.10.17±3.10%,P<0.001)；WJ-NSC与WJ-MSC相比表现更强的nestin、sox2和musashi荧光信号(nestin,83.57±2.60%vs.19.22±2.96%,P<0.001；sox2,71.17±3.63%vs.21.11±2.51%,P<0.001；Musashi,64.15±3.81%vs.12.62±2.58%,P<0.001).有意思的是诱导后AM-NSC与WJ-NSC相比表现更强的mestin荧光信号但sox2和musashi未见显著差异(nestin,92.1±2.82%vs.83.6±22.52%,P=0.0497:sox2,70.2±3.26%vs.71.2±3.54%, P=0.816:Musashil,67.0±3.67%vs.64.0±3.89%,P=0.559).实时定量PCR结果和Western blot结果与免疫细胞化学结果一致。我们对两种来源细胞的间充质干细胞在诱导前后分泌神经营养因子的能力的变化情况进行的检测。我们检测了BDNF、GDNF、NT-3、CNTF和NGF。具体的ELISA结果如下：AM-MSC分泌因子的情况,BDNF,109.51±15.26pg/mL, GDNF32.85±14.21pg/mL,NT-327.43±11.91pg/mL,CNTF39.62±13.56pg/mL和NGF21.46±9.83pg/mL；诱导之后AM-NSC分泌因子情况,BDNF,477.39±39.95pg/mL,GDNF101.01±11.67pg/mL,NT-3206.33±26.36pg/mL,CNTF160.48±22.69pg/mL和NGF185.23±23.59pg/m。WJ-MSC分泌因子情况,BDNF,241.69±25.90pg/mL,GDNF16.21±10.01pg/mL,NT-3172.35±25.20pg/mL,CNTF34.37±11.42pg/mL和NGF105.59±18.24pg/mL；诱导之后WJ-NSC分泌因子情况,BDNF,333.66±31.59pg/mL,GDNF93.64±19.17pg/mL,NT-3122.46±20.02pg/mL,CNTF231.28±22.07pg/mL和NGF32.76±10.17pg/mL。组间比较结果显示诱导前WJ-MSC与AM-MSC相比表达高的BDNF(P=0.006).NT-3(P<0.001)和NGF(P=0.002)。而有意思的是诱导后AM-NSC却比WJ-NSC表达更高的BDNF(P=0.003).NT-3(P=0.015)、 CNTF(P=0.014)和NGF(P=0.009)。实时定量PCR的结果与上述的ELISA结果一致。结论：我们成功的将AM-MSC和WJ-MSC诱导为AM-NSC和WJ-NSC。这些诱导得到的NSC与未诱导的间充质干细胞相比表达更高的NSC标志。诱导之前WJ-MSC和AM-MSC相比表达更多的BDNF、NT-3和NGF,然而诱导之后AM-NSC却比WJ-NSC表达更高的BDNF、NT-3、CNTF和NGF。由此可见来自新生儿附属组织不同部位的间充质干细胞对同一神经干细胞诱导方法的反应不完全相同,相比之下AM-MSC对神经干细胞诱导的反应更有利于神经营养因子的分泌。第三部分AM-MSC和WJ-MSC体外细胞因子抗体芯片检测和抗凋亡能力的检测目的：我们运用人细胞因子抗体芯片对两种来源间充质干细胞分泌细胞因子的能力进行检测。通过过氧化氢和去血清培养诱导AM-MSC和WJ-MSC凋亡,并检测其抗凋亡能力。方法：在本研究中我们使用人细胞因子抗体芯片(Human L-507Array, RayBiotech Inc.)检测两种间充干细胞所分泌的507种细胞因子。我们用化学发光的方法来探测膜上的信号强度,信号的强度通过光密度计来进行定量。对于数值差别在两倍以上的因子,我们对其进行统计学分析。我们选用阳性对照对来自各张膜的数值进行标准化。本实验中采用2mmol/L的H202和去血清培养来诱导细胞凋亡。诱导凋亡的细胞以末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸生物素缺口末端标记法(TUNEL)和Annexin V和propidine碘(PI)染色来进行测定。结果：细胞因子抗体芯片的结果如下：与WJ-MSC相比AM-MSC中检测到有23种细胞因子高表达差异倍数在两倍以上；而在WJ-MSC中有49种细胞因子相对AM-MSC高表达差异倍数在两倍以上。在AM-MSC中高表达的23种细胞因子中,有4种因子差异有统计学意义；而在WJ-MSC中两倍以上高表达的49种因子,统计结果显示差异没有统计学意义。在AM-MSC中上调的4种因子为白细胞介素(interleukin,IL)或者白细胞介素的受体。具体的细胞因子如下：IL-6(t=3.546,P=0.038),IL-13R alpha2(t=3.336,P=0.045),IL-12p70(t=3.743,P=0.033),IL-22R(t=3.187,P=0.0498)。H202诱导凋亡后,TUNEL法检测AM-MSC和WJ-MSC细胞凋亡率(27.94±2.31%vs.35.70±2.27%,t=2.401,P=0.043),Annexin V/PI染色方法检测细胞凋亡率(31.31±2.05%vs.39.52±2.65%,t=2.448,P,=0.040)；去血清培养诱导凋亡后,Annexin V/PI染色方法检测细胞凋亡率(8.23±0.91%vs.11.71±1.13%,t=2.396,P=0.043).结果显示AM-MSC无论在过氧化氢还是去血清培养诱导的细胞凋亡中都比WJ-MSC显示更强的抗凋亡能力。结论：与WJ-MSC相比AM-MSC表达更多的细胞因子,这些细胞因子主要为细胞介素,它们可能与细胞的增殖和炎症反应有关。AM-MSC比WJ-MSC具有更强的抗凋亡能力。