食管鳞癌(Esophageal squamous cell cancer, ESCC)是发生在食管鳞状上皮的恶性肿瘤。食管癌的死亡率位居世界第六位,全世界每年约有20万人死于食管癌。世界卫生组织报道食管癌发病率在近20年持续升高。我国是食管癌的高发国家,也是本病死亡率最高的国家。目前普遍认为ESCC是多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病,然而其发生和发展的确切机制仍未阐明。而在生物分子机制上认为是表型遗传调控和细胞内遗传调控紊乱作用的结果。作为表观遗传调控的重要方式,DNA甲基化在肿瘤发生中的作用一直是医学研究的热点。而甲基化状态的异常在肿瘤中起着很重要的作用,这种异常的状态主要表现在基因组DNA低甲基化,特定基因启动子区局部高甲基化和甲基化转移酶的高表达。它在肿瘤中作用的机制是导致基因组的不稳定性增加,如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达等。同时在食管癌的发生机制中,DNA损伤也起着一定的作用,而作为DNA损伤修复基因----Gadd45a(Growth arrest and DNA-damage-inducible protein45alpha,即生长停滞与DNA损伤诱导蛋白)也应该参与其中。目前的研究认为Gadd45α在肿瘤中的作用机制为：一、通过通过抑制细胞生长以及促进DNA损伤修复等间接或者直接方式维持基因组稳定性,从而抑制细胞转化和肿瘤的恶性进展。二、Gadd45α还可通过对一些信号传导通路的调节,参与肿瘤发生发展的抑制。三、、最新的研究结果显示Gadd45α可通过促进DNA修复,去除甲基化标记,从而减少表观遗传基因的沉默。于是我们设想在DNA损伤的食管癌中,Gadd45α的作用是怎样的?表达是否异常,甲基化状态是否异常,是否影响食管癌的总体甲基化。完成这一设想的验证工作需要以下几部分：1、比较食管癌组织和癌旁组织中Gadd45α mRNA和蛋白水平的表达及启动子区甲基化状态。比较食管癌组织和癌旁组织中总体甲基化水平。2、在食管癌细胞中下调Gadd45α后,总体甲基化的变化,以及食管癌细胞的变化。在正常食管组织细胞中上调Gadd45α,总体甲基化水平的变化。为Gadd45α在食管癌中的表达及作用机制寻找理论依据。第一部分食管癌组织中Gadd45α的表达及甲基化情况第一节食管癌组织中Gadd45的表达及与病理分期的关系目的：通过比较Gadd45在食管癌组织和癌旁组织中的表达,来明确Gadd45各型在食管癌组织中表达的高低。方法：利用Real-time RT-PCR的方法分别从mRNA水平检测40例食管癌患者肿瘤组织和癌旁组织中Gadd45α、Gadd45β与Gadd45γ基因的表达,对于有差异的再进行免疫组化检测,在蛋白水平上进一步验证。同时分析Gadd45α mRNA与与患者病理分期的关系。结果：通过与食管癌的癌旁组织比较,食管癌组织中Gadd45α mRNA及蛋白水平均有显著性的升高(P<0.05), Gadd45β与Gadd45γ mRNA在两组见无明显差异(P>0.05)。Gadd45α mRNA在Ⅰ期与Ⅱa/Ⅱb/Ⅲ期之间有显著性差异(P<0.01),而在Ⅱa,Ⅱb与Ⅲ期之间比较无明显统计学差异(P>0.05)；在肿瘤侵犯情况,Gadd45αmRNA在T1/2与T3/4之间有显著性差异(P<0.01)；在淋巴结转移上,Gadd45α mRNA在NO、N2和N3之间均有显著性差异(P<0.01)。结论：食管癌患者组织中Gadd45α表达显著升高,且与肿瘤侵犯和淋巴结转移有关。第二节食管癌组织中总体甲基化情况及Gadd45α启动子区甲基化情况目的：通过分析食管癌组织中总体甲基化情况及Gadd45a启动子区甲基化情况,来探讨Gadd45a启动子区甲基化、食管癌总体甲基化与食管癌之间的关系。方法：采用试剂盒检测食管癌基因组DNA总体甲基化水平及亚硫酸氢钠基因组测序法检测Gadd45a序列特异性甲基化情况。结果：与食管癌的癌旁组织相比,食管癌组织中Gadd45a启动子区甲基化是降低的,并且与Gadd45a mRNA呈负相关。食管癌的总体甲基化是降低的,与Gadd45a mRNA呈负相关。结论：食管癌组织中Gadd45a启动子区甲基化及全基因组总体甲基化是降低的,并且与Gadd45a mRNA呈负相关。第二部分下调或诱导Gadd45α表达来分析DNA甲基化水平的影响及Gadd45α在食管癌中的功能分析第一节下调Gadd45α表达对DNA甲基化水平的影响及Gadd45α的功能分析目的：研究下调食管癌的细胞株(Eca109和Kyse510)中Gadd45α表达对DNA甲基化水平的影响,以及进行Gadd45α在食管癌中的功能分析。方法：利用RNA干扰技术,通过脂质体2000转染食管癌细胞来下调Gadd45α表达,检测下调后的DNA总体甲基化水平,以及检测下调Gadd45α后食管癌细胞的增殖,凋亡及对化疗药(顺铂)的敏感性。结果：(1)通过检测转染后食管癌细胞中Gadd45α mRNA和蛋白水平,证实转染后的食管癌细胞中Gadd45α被下调。下调Gadd45α后,食管癌细胞中基因组总体甲基化水平升高,且有显著性差异(P<0.05)。(2)细胞转染后,实验组(Gadd45α-siRNA)中细胞增殖能力低于阴性对照组(NC-siRNA),且有显著性差异(P<0.05)；下调Gadd45α组中食管癌细胞的凋亡数量高于阴性对照组,且有统计学上的差异(P<0.05)；下调Gadd45α组中食管癌细胞对顺铂的敏感性显著性降低(P<0.05)。结论：下调Gadd45α后,食管癌基因组总体甲基化水平降低,细胞增殖能力下降,凋亡增强,对顺铂的敏感性下降。第二节诱导正常食管细胞Gadd45α表达对DNA甲基化水平的影响目的：研究使正常食管细胞中Gadd45α过表达对DNA甲基化水平的影响。方法：构建Gadd45α表达的质粒pcDNA3.1-Gadd45α,利用脂质体2000进行细胞转染。利用Real-time RT-PCR法检测转染后细胞的Gadd45α mRNA和采用试剂盒方法检测细胞基因组DNA总体甲基化水平的。结果：转染后细胞中,Gadd45α mRNA显著性增高(P<0.05),总体甲基化水平显著性降低(P<0.05)。结论：上调正常食管粘膜细胞中Gadd45α的表达,基因组DNA总体甲基化水平降低。第三部分甲基化转移酶在食管癌中的检测及意义目的：检测食管癌肿瘤组织及癌旁组织中甲基化转移酶的表达,来分析甲基化转移酶在食管癌中的意义。方法：利用Real-time RT-PCR法检测食管癌肿瘤组织及癌旁组织中甲基化转移酶的表达并进行比较。将甲基化转移酶的表达与临床病理、Gadd45α启动子区甲基化及基因组整体甲基化之间的相关性。结果：在食管癌的肿瘤组织中,DNMT1和DNMT3b表达高于癌旁组织,DNMT3a在两组之间没有显著性的差异。DNMT1mRNA. DNMT3b mRNA与临床病理有关,与基因组整体甲基化没有显著性相关,与Gadd45α启动子区甲基化水平呈负相关。结论：甲基化转移酶中,DNMT1和DNMT3b在食管癌中表达增高,并且与Gadd45α启动子区甲基化水平呈负相关。