【摘 要】
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目的：将真核重组载体pEGFP-NDPK-A、pEGFP-NDPK-AC4S、pEGFP-NDPK-AC4/109/145S瞬时转染人肺腺癌A549细胞中,研究对人肺腺癌A549细胞增殖,细胞周期和细胞凋亡的影响,比较野生型NDKP-A及其Cys突变体的生物活性差异。通过研究阿霉素和17-AAG与nm23-H1基因表达的关系,为抗肿瘤药物研发提供数据。研究NDPK-A及其Cys突变体对vero细胞
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目的：将真核重组载体pEGFP-NDPK-A、pEGFP-NDPK-AC4S、pEGFP-NDPK-AC4/109/145S瞬时转染人肺腺癌A549细胞中,研究对人肺腺癌A549细胞增殖,细胞周期和细胞凋亡的影响,比较野生型NDKP-A及其Cys突变体的生物活性差异。通过研究阿霉素和17-AAG与nm23-H1基因表达的关系,为抗肿瘤药物研发提供数据。研究NDPK-A及其Cys突变体对vero细胞的细胞周期的影响,比较NDPK-A及其Cys突变体对正常细胞和肿瘤细胞作用的异同。方法：pEGFP-NDPK-A、pEGFP-NDPK-AC4S、pEGFP-NDPK-AC4/109/145S三种质粒利用脂质体瞬时转染A549细胞,通过DNA延滞实验和流式细胞仪检测确定最高转染效率；Western blot法确定NDKP-A及其Cys突变体在胞内的表达,荧光共聚焦法检测NDKP-A及其Cys突变体在胞内的定位；利用MTT法检测NDPK-A及其Cys突变体对细胞增殖的影响；利用Hoechst 33342、PI双染色和PI单染色,流式细胞仪分选绿色荧光细胞,分别检测NDPK-A、C4S和C4/109/145S突变体对A549细胞周期,vero细胞周期和诱导A549细胞凋亡的作用；Western blot法检测抗肿瘤药物阿霉素和17-AAG对A549细胞nm23-H1基因表达的影响。结果：真核重组质粒pEGFP-NDPK-A、pEGFP-NDPK-A C4S和pEGFP-NDPK-AC4/109/145S在A549细胞中均能以绿色融合蛋白形式表达,且蛋白大部分表达于胞浆中,分子量约为50kD; NDPK-A, C4S与C4/109/145S突变体对A549细胞增殖均有增殖抑制作用,C4S突变体增殖抑制活性最强；NDPK-A及其Cys突变体均能对A549细胞周期进行一定调控,并具诱导细胞凋亡活性,野生型NDPK-A促凋亡活性高于C4S和C4/109/145S突变体；阿霉素对胞内nm23-H1基因表达有浓度抑制现象,高浓度抑制肿瘤细胞内nm23-H1基因的表达,而17-AAG低浓度促进nm23-H1基因的表达,高浓度抑制其表达。NDPK-A在vero细胞中有一定的周期调控作用,而C4S突变体对细胞周期无显著影响。结论：已构建的重组质粒pEGFP-NDPK-A、pEGFP-NDPK-A C4S、pEGFP-NDPK-AC4/109/145S在A549细胞中均能以绿色荧光融合蛋白形式表达于胞浆中,是研究其胞内活性的重要条件；与野生型NDPK-A相比,C4S与C4/109/145S突变体有不同的生物活性,在促肿瘤细胞增殖和凋亡上均有一定程度的变化,并对肿瘤细胞周期有重要影响,但在vero细胞中,NDPK-A与C4S突变体的周期调控作用也不相同,这为nm23-Hl/NDPK-A活性研究及基因治疗奠定了基础。探究抗肿瘤药物阿霉素、17-AAG与胞内nm23-H1基因表达之间的关系,利于探究抗肿瘤药物作用机制和NDPK-A抗肿瘤功能药物进一步研发。
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