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背景与目的镉（cadmium,Cd）是一种环境重金属污染物,机体长期暴露于Cd可导致肝、肾、肺、骨以及消化道损伤。据新近研究,Cd暴露可能通过促进动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）发生,增加心血管疾病的发生风险。但是,Cd促进AS发生的机制尚不清楚。巨噬细胞极化为M1型是AS发生的关键环节,Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活子3信号通路（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3）信号通路激活可促进巨噬细胞极化为M1型。Cd可能通过激活JAK2/STAT3信号通路促进巨噬细胞极化为M1型促进AS发生。姜黄素作为植物活性物质对心血管疾病具有保护效应,但姜黄素在Cd暴露所促进的AS发生中的干预作用尚未见报道。本研究拟通过体内外研究明确Cd促进AS发生过程中巨噬细胞极化的作用,并在此基础上论证JAK2/STAT3信号通路在Cd促进巨噬细胞极化及ApoE-/-小鼠AS发生中的作用。最后结合体内外干预研究明确姜黄素对Cd促进ApoE-/-小鼠AS发生的保护效应及其机制。方法1.巨噬细胞极化在Cd促AS中的作用研究（1）Cd对ApoE-/-小鼠AS的剂量反应关系ApoE-/-小鼠通过饮水暴露于0、50、100及200 mg/L氯化镉（Cadmium chloride,CdCl2）12周。收集小鼠心血管组织,通过油红O染色观察主动脉斑块形成情况;收集小鼠血浆,检测TG、T-CHO、LDL及HDL观察血脂变化情况;酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测 AS 分子标志物VCAM-1浓度。明确Cd促AS模型构建的最佳浓度。（2）Cd对ApoE-/-小鼠巨噬细胞极化的调控作用ApoE-/-小鼠通过饮水接触或不接触100 mg/L CdCl2 12周,收集主动脉组织、血液及尿液。ICP-MS测血液、尿液及组织中Cd浓度;QRT-PCR分析F4/80、CD86、CD206、TNF-α、IL-6以及IL-4的mRNA水平;免疫荧光分析组织CD86与CD206表达情况;ELISA测血浆TNF-α、IL-6以及IL-4水平。明确Cd暴露促进AS发生过程中对巨噬细胞极化的调控作用。（3）Cd对小鼠巨噬细胞RAW264.7极化的调控作用RAW264.7 细胞经不同浓度（0、0.38、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0 以及 24.0μmol/L）CdCl2处理24小时后,通过CCK-8测定细胞活性,明确不影响细胞活性对的最大浓度值。RAW264.7 细胞经 0、0.75、1.5 以及 3.0 μmol/L CdCl2 处理 24 小时。QRT-PCR分析CD86、CD206、TNF-α、IL-6以及IL-4的mRNA水平;流式细胞术测CD86以及CD206荧光强度,ELISA测细胞培养上清TNF-α、IL-6以及IL-4水平。2.JAK2/STAT3信号通路在Cd促巨噬细胞极化中的机制研究（1）Cd对ApoE-/-小鼠主动脉JAK2/STAT3信号通路的调控作用ApoE-/-小鼠通过饮水接触或不接触于100 mg/L CdCl2 12周,收集心血管组织。QRT-PCR分析主动脉组织JAK2与STAT3的mRNA水平;免疫组化分析主动脉组织中JAK2/STAT3表达情况。观察Cd暴露对ApoE-/-小鼠JAK2/STAT3信号通路表达的调控作用。（2）Cd对RAW264.7细胞JAK2/STAT3信号通路的调控作用RAW264.7 细胞经 0、0.75、1.5 以及 3.0 μmol/L CdCl2 处理 24 小时。QRT-PCR分析 JAK2 与 STAT3 的 mRNA 水平;western-blot 检测细胞 JAK2、STAT3、p-JAK2以及p-STAT3表达情况。明确Cd暴露对RAW264.7细胞JAK2/STAT3信号通路表达的调控作用。（3）JAK2/STAT3信号通路在Cd引起RAW264.7细胞极化中的作用机制RAW264.7加或不加pacritinib预处理30分钟后,3.0 CdCl2处理24小时。western-blot 检测细胞 JAK2、STAT3、p-JAK2 以及 p-STAT3 表达情况;QRT-PCR 分析 CD86、CD206、JAK2、STAT3、TNF-α、IL-6 以及 IL-4 的 mRNA水平;流式细胞术测CD86以及CD206荧光强度;ELISA测细胞培养上清TNF-α、IL-6以及IL-4水平。明确JAK2/STAT3信号通路在Cd所致巨噬细胞极化中的作用。3.姜黄素对Cd暴露致AS的干预效应研究（1）姜黄素对Cd暴露致ApoE--小鼠AS的干预效应ApoE-/-小鼠采用100 mg/L CdCl2经饮水法进行造模,同时给与100 mg/kg姜黄素进行灌胃。12周后收集小鼠心血管组织以及血浆,油红O染色及病理检测观察主动脉斑块形成情况;TG、T-CHO、LDL及HDL检测血脂改变情况;ELISA测AS分子标志物VCAM-1表达情况。明确姜黄素对Cd暴露促进的AS的保护效应。（2）姜黄素对Cd所致巨噬细胞极化的调控作用ApoE-/-小鼠采用100 mg/LCdCl2经饮水法进行造模,同时给与100 mg/kg姜黄素进行灌胃。12周后收集小鼠心血管组织、血浆以及尿液。ICP-MS测血液、尿液及组织中 Cd 浓度;QRT-PCR 分析 F4/80、CD86、CD206、TNF-α、IL-6 以及IL-4的mRNA水平;免疫荧光分析组织CD86与CD206表达情况;ELISA测血浆TNF-α、IL-6以及IL-4水平。观察姜黄素对Cd暴露促进AS发挥保护效应过程中对巨噬细胞极化的调控作用。RAW264.7细胞通过姜黄素预处理30分钟后,再通过3.0 μmol/LCdCl2处理24 小时。QRT-PCR 分析 CD86、CD206、TNF-α、IL-6 以及 IL-4 的 mRNA 水平;流式细胞术测CD86以及CD206荧光强度;ELISA测细胞培养上清TNF-α、IL-6以及IL-4水平。明确姜黄素对Cd暴露所致巨噬细胞极化的调控作用。（3）姜黄素对Cd激活JAK2/STAT3信号通路的调控作用ApoE-/-小鼠采用100 mg/L CdCl2经饮水法进行造模,再通过100 mg/kg姜黄素进行灌胃。12周后收集小鼠心血管组织。QRT-PCR分析JAK2以及STAT3的mRNA水平;免疫组化分析JAK2/STAT3信号通路表达情况。观察姜黄素对Cd暴露激活ApoE-/-小鼠JAK2/STAT3信号通路的调控作用。RAW264.7细胞通过姜黄素预处理30分钟后,再通过3.0 μmol/LCdCl2处理24小时。QRT-PCR分析JAK2以及STAT3的mRNA水平;western-blot检测细胞JAK2、STAT3、p-JAK2以及p-STAT3表达。明确姜黄素对Cd激活RAW264.7细胞JAK2/STAT3信号通路的调控作用。结果1.巨噬细胞极化在Cd促进AS中的作用研究（1）Cd呈剂量反应关系促进ApoE-/-小鼠AS发生与对照组相比,Cd暴露促进ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块形成;提高血浆TG、T-CHO、LDL以及VCAM-1水平;抑制HDL水平。100mg/LCdCl2为构建模型的最佳剂量。（2）Cd促进ApoE-/-小鼠巨噬细胞M1型极化ApoE-/-小鼠通过饮水法摄入100 mg/L CdCl2 12周。对照组小鼠血液、尿液及心血管组织中Cd浓度低于检测限值,100 mg/LCdCl2组血液、尿液及心血管组织中可检测到Cd。ApoE-/-小鼠通过饮水法摄入100 mg/L CdCl2 12周,促进主动脉根部炎性细胞浸润以及主动脉根部CD86表达,对CD206的表达无显著影响;促进TNF-α与IL-6表达,对IL-4无显著影响。100mg/LCdCl2促进ApoE-/-小鼠主动脉巨噬细胞M1型极化。（3）Cd促进RAW264.7细胞极化为M1型3.0μmol/LCdCl2为不影响RAW264.7细胞活性的最大浓度。通过0.75、1.5以及3.0 μmol/L CdCl2处理RAW264.7细胞24小时,可促进细胞CD86、TNF-α与IL-6表达,对CD206与IL-4表达无显著影响。Cd可致RAW264.7细胞极化为M1型。2.JAK2/STAT3在Cd促进巨噬细胞极化中的机制研究（1）Cd促进ApoE-/-小鼠主动脉根部JAK2/STAT3信号通路表达与对照组相比,100 mg/L CdCl2促进ApoE--小鼠主动脉根部斑块部位JAK2/STAT3信号通路表达。（2）Cd激活巨噬细胞JAK2/STAT3信号通路与对照组相比,0.75、1.5以及3.0μmol/L CdCl2处理RAW264.7细胞24小时可激活JAK2/STAT3信号通路。其中3.0 μmol/LCdCl2最为显著。（3）抑制JAK2/STAT3信号通路激活可拮抗Cd所致巨噬细胞M1型极化通过pacritinib抑制剂预处理RAW264.7细胞后,与CdCl2组相比,对照组,pacritinib 组以及 CdCl2+pacritinib 组 CD86、TNF-α与 IL-6 表达降低,对 CD206与IL-4表达影响不显著。3.姜黄素对Cd暴露致AS的干预效应研究（1）姜黄素可改善Cd促进的AS通过姜黄素干预后,与100 mg/LCdCl2组相比对照组,姜黄素组以及CdCl2+姜黄素组ApoE-/-小鼠斑块形成降低;血浆VCAM-1水平降低;血浆HDL水平上调;但血浆TG、T-CHO以及LDL在CdCl2组与CdCl2+姜黄素组无显著差异。（2）姜黄素可拮抗Cd所致巨噬细胞M1型极化ApoE-/-小鼠采用100 mg/L CdCl2经饮水法进行造模,并行100 mg/kg姜黄素灌胃12周后,与100mg/LCdCl2组比较,CdCl2+姜黄素组血液、尿液及心血管组织中Cd浓度无统计学意义;对照组、姜黄素组以及CdCl2+姜黄素组小鼠CD86、TNF-α与IL-6表达较CdCl2组低;CD206在对照组,姜黄素组以及CdCl2+姜黄素组表达较CdCl2组高,IL-4在各组无显著差异。RAW264.7细胞通过姜黄素预处理30分钟后,再通过3.0 μmol/L CdCl2处理24小时,与CdCl2组相比,对照组、姜黄素组以及CdCl2+姜黄素组CD86、TNF-α与IL-6表达降低;CD206在对照组、姜黄素组以及CdCl2+姜黄素组表达较CdCl2组升高;IL-4表达在各组无显著影响。（3）姜黄素可拮抗Cd所致JAK2/STAT3信号通路激活ApoE-/-小鼠采用100 mg/LCdCl2经饮水法进行造模,并给予100 mg/kg姜黄素进行灌胃12周后,与100mg/LCdCl2组相比,对照组、姜黄素组以及CdCl2+姜黄素组主动脉根部组织中JAK2/STAT3信号通路表达下调。RAW264.7细胞通过姜黄素预处理30分钟后,再采用3.0 μmol/L CdCl2处理24小时,与CdCl2组相比,对照组、姜黄素组以及CdCl2+姜黄素组JAK2/STAT3信号通路表达下调。结论1.50、100及200 mg/L CdCl2可呈剂量反应关系促进AS发生,以100 mg/L为最佳造模剂量;2.Cd进入机体后可通过蓄积于心血管组织,激活巨噬细胞JAK2/STAT3信号通路促进巨噬细胞向M1型极化,最终促进ApoE-/-小鼠AS发生;3.在本实验条件下,姜黄素对Cd致ApoE-/-小鼠AS发生具有干预效应。姜黄素对Cd促进的AS的保护效应主要是通过抑制巨噬细胞JAK2/STAT3信号通路,拮抗Cd所致巨噬细胞极化为M1型。