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目的:本研究是为了探究Fox O3a与RUNX1在软骨分化中的相互作用机制,并以Fox O3a为靶点来初步研究新补骨脂异黄酮对LPS诱导的骨关节炎的治疗作用。方法:1、使用1%胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium（ITS））分别刺激ATDC5细胞7、14、21天,建立软骨分化模型,采用阿尔新蓝染色、茜素红染色分别检测蛋白聚糖的合成情况和软骨矿化情况以及采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测不同时间点软骨细胞增殖期标志物（Col2、Aggrecan和Sox9）以及肥大期标志物（RUNX2、Col X和MMP13）,来确定软骨分化模型建立成功。2、采用免疫印迹法检测软骨分化过程中Fox O3a、p-Fox O3a（ser253）、RUNX1以及RUNX2表达变化情况。3、采用Lipo3000转染Fox O3a si RNA来敲低ATDC5细胞中Fox O3a的表达,q RT-PCR检测软骨分化过程中标志基因的表达。4、构建高表达GFP-Fox O3a的慢病毒对ATDC5细胞进行感染使其高表达,检测软骨分化过程中标志基因的表达。5、采用免疫荧光检测ATDC5细胞和小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）分化过程中Fox O3a与RUNX1表达与共定位情况。6、采用蛋白免疫共沉淀检测ATDC5细胞在ITS刺激不同时间时Fox O3a与RUNX1相互作用强度。7、取新生昆明小鼠膝关节软骨经过固定、脱钙、脱水后进行冰冻切片,采用western blot和免疫荧光染色检测体内关节软骨中Fox O3a和RUNX1的表达情况和位置关系。8、采用10μg/ml的LPS对ATDC5细胞进行造模,不同浓度的新补骨脂异黄酮进行治疗,CCK-8、ELISA试剂盒和免疫印迹法分别检测新补骨脂异黄酮对LPS诱导的ATDC5细胞增殖、炎症因子和蛋白表达的影响。结果:1、我们的数据表明在ITS刺激下,蛋白聚糖和细胞矿化随刺激时间的增加均显著增强,表明ITS刺激下软骨分化逐渐加强,同时q RT-PCR结果也显示增殖期标志性基因（Col2、Aggrecan和Sox9）表达逐渐增加,且Sox9在第14天达到峰值;肥大期标志性基因（RUNX2、Col X和MMP13）持续增加,且在21天达到峰值。2、在软骨分化过程中Fox O3a表达逐渐增加,且在第14天达到峰值,并在第21天仍维持在高水平状态,而是失活状态的p-Fox O3a表达始终逐渐减少,同时RUNX1和RUNX2的表达也是随刺激时间增加蛋白表达水平逐渐增加。3、使用特异性敲低Fox O3a si RNA转染后,与对照相比,软骨分化增殖期标志性基因（Sox9、Col2）和肥大期标志性基因（Col X、MMP13和ADATMs-5）m RNA的表达显著降低,且RUNX1 m RNA表达也降低。4、而高表达Fox O3a后,与对照病毒相比,软骨分化增殖期标志性基因（Sox9）和肥大期标志性基因（Col X、MMP13和ADATMs-5）m RNA的表达显著升高,且RUNX1 m RNA表达也升高。5、在ATDC5细胞中Fox O3a和RUNX1表达存在共定位现象;同时在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中Fox O3a和RUNX1表达逐渐增加,且两者共定位作用加强。6、蛋白免疫共沉淀结果显示在ATDC5细胞中Fox O3a与RUNX1存在相互作用,并且在软骨分化过程中两者结合作用表达水平逐渐增强。7、在小鼠膝关节内Fox O3a和RUNX1主要表达在软骨的浅表层,并且在软骨早期发育过程中Fox O3a和RUNX1的表达水平逐渐增加,且两者存在共定位。8、新补骨脂异黄酮能够抑制LPS诱导的ATDC5细胞死亡,并存在剂量依赖性,同时能够逆转LPS促进的炎症因子IL-1β、IL-6的表达以及能够逆转LPS抑制的Fox O3a、RUNX1和RUNX2蛋白表达。结论:1、1%ITS能够刺激ATDC细胞向成熟软骨细胞分化,我们通过该作用成功建立软骨细胞分化模型。2、在软骨分化过程中Fox O3a和RUNX1的蛋白表达均增加且在21天时仍处在高水平表达状态,表明Fox O3a在软骨分化过程起到了重要作用。3、敲低Fox O3a抑制了软骨分化增殖期和肥大期标志性基因m RNA的表达,同时抑制了RUNX1 m RNA的表达,表明Fox O3a能够促进软骨细胞的早期分化和终末肥大。4、高表达Fox O3a促进了软骨分化增殖期和肥大期标志性基因m RNA的表达,同时促进了RUNX1 m RNA的表达,进一步证明Fox O3a能够促进软骨细胞的早期分化和终末肥大,并且Fox O3a与RUNX1可能存在相互作用。5、在骨髓间充质干细胞向成熟软骨细胞分化过程中Fox O3a和RUNX1表达均增加,表明在体内软骨细胞成熟过程中Fox O3a和RUNX1也起到促进软骨细胞分化作用。并且两者存在共定位,同时在ATDC5细胞中Fox O3a和RUNX1也存在共定位,表明在软骨干细胞和骨髓间充质干细胞分化过程中Fox O3a和RUNX1存在相互作用。6、在ATDC5细胞中Fox O3a与RUNX1的确存在相互作用,并且在软骨细胞分化过程中两者相互作用的表达水平逐渐增强。7、在新生小鼠膝关节软骨中Fox O3a和RUNX1在软骨浅表层中存在共定位,进一步说明在体内Fox O3a和RUNX1也存在相互作用,共同促进体内软骨分化。8、新补骨脂异黄酮具有抑制LPS诱导的ATDC5细胞死亡的作用,并且该作用可通过Fox O3a调节炎症来实现的。