2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE)是一种芳香醇,它因具有清甜的玫瑰花香味而颇受人们喜爱,广泛应用于食品、化妆品和医药行业。利用酿酒酵母发酵2-苯乙醇是生产天然2-苯乙醇的主要途径,然而2-苯乙醇对酿酒酵母生长的抑制作用是生物法合成2-苯乙醇的瓶颈之一。选育2-苯乙醇耐受性酿酒酵母是克服高浓度2-苯乙醇的抑制作用,提高2-苯乙醇产量的一条重要途径。本实验对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WHU2a进行紫外诱变育种,通过紫外致死曲线分析,选取致死率为80%的条件进行了10个批次的诱变育种。共计做了150个摇瓶,最终获得了2株2-苯乙醇耐受性菌株YL-1和YL-2。传代培养后通过对突变株遗传稳定性试验发现,突变株YL-1和YL-2在2.8g/L 2-苯乙醇平板上生长状况明显优于对照菌。最后通过高效液相色谱(HPLC)分析出YL-2发酵2-苯乙醇产量较原始菌株提高了约10%。本研究将全局转录工程技术(gTME)应用到选育2-苯乙醇耐受性酿酒酵母中,初步构建了全局转录工程方法。首先提取了实验室酿酒酵母S.cerevisiae CWY132的基因组,利用易错PCR扩增获得了编码一种TATA结合蛋白的spt15基因片段,然后将易错PCR产物连接至载体PRS314-PGK1上,并转化大肠杆菌DH5α构建突变体库,本研究共获得了2.5×10~4个大肠杆菌转化子。提取大肠杆菌转化子质粒,再用醋酸锂转化法将突变体库的质粒转化宿主酵母S.cerevisiae WHU2a,最后在3个含高浓度2-苯乙醇的液体摇瓶中筛选出耐受性最好的突变株CY-1。在3.2g/L 2-苯乙醇的液体摇瓶中,耐受性菌株CY-1的生长优于酿酒酵母WHU2a,尤其是在对数生长期的优势最明显。经TA克隆并测序比对发现,突变的spt15基因上有3处碱基发生突变。之后通过BLAST比对酿酒酵母中SPT15蛋白的氨基酸序列,可以看出突变基因所编码的氨基酸序列发生2处改变:(1)第44位的氨基酸由谷氨酸突变成了天冬氨酸;(2)第53位的氨基酸由精氨酸突变成了酪氨酸。利用高效液相色谱测得突变株CY-1发酵2-苯乙醇产量较出发菌株提高了13%,推测突变的氨基酸序列可能与2-苯乙醇耐受性有关,可能更多的是参与调控2-苯乙醇耐受性相关基因的表达。