[目的]研究龙胆苦苷(gentiopicroside,GPS)对博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导小鼠肺纤维化的治疗作用,体外细胞水平进一步研究龙胆苦苷的抗肺纤维化作用,并初步探讨其作用机制。[方法]1.采用单次气管滴入BLM制备小鼠肺纤维化模型,同时给予腹腔注射龙胆苦苷,每天一次,连续给药28天,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺组织样本,测定肺系数。2.光镜下HE染色和Masson染色评价肺组织病理学改变。3.BCA蛋白浓度测定试剂盒检测BALF的蛋白浓度,进行细胞涂片,光镜下进行细胞计数分类。4.羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)试剂盒检测肺组织中羟脯氨酸的含量。5.体外培养RAW264.7、A549、MRC-5细胞,观察其形态和生长状态,绘制细胞生长曲线。6.MTT法检测不同浓度的龙胆苦苷对RAW264.7、A549、MRC-5细胞的IC50,评价龙胆苦苷的体外细胞毒性。7.免疫细胞化学方法检测龙胆苦苷对BLM诱导A549的相关凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达影响。流式细胞术检测龙胆苦苷对BLM诱导A549细胞凋亡的影响。8.免疫细胞化学方法检测龙胆苦苷对TGF-βl诱导A549发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关的细胞表面标志物 E-caherin和α-SMA表达变化的影响。9.免疫细胞化学方法检测龙胆苦苷对TGF-β1诱导MRC-5分化为肌成纤维细胞的α-SMA表达变化的影响。10.免疫细胞化学方法和Western blot检测龙胆苦苷对脂多糖(Lipopolysaccharid,LPS)诱导RAW264.7的NF-κB-p65表达变化的影响[结果]1.与NS组比较,龙胆苦苷各剂量组小鼠体重变化无统计学意义。龙胆苦苷各剂量均可降低小鼠肺系数,但与模型组比较,差异无统计学意义。2.HE染色和Masson染色观察各组小鼠肺组织病理学改变,发现生理盐水组小鼠肺泡结构正常清晰,肺泡腔完好,肺泡壁薄未见增厚,肺泡腔和肺间质几乎无炎性细胞渗出,无纤维化现象;模型组小鼠肺泡腔缩小,肺泡上皮细胞大量增生,肺泡炎症明显,肺组织有大量炎性细胞浸润,弥漫性肺泡间隔增厚,病灶内部分肺泡塌陷,纤维组织增生,并形成片状肺组织实变,;与模型组比较,地塞米松组和龙胆苦苷组小鼠肺泡上皮增生,局部肺泡间隔增厚,肺泡腔和肺间质有少量炎性细胞浸润,炎性病理性改变明显减轻,其中高剂量给药组小鼠病变反应较中剂量和低剂量组轻。3.与NS组比较,模型组BALF中蛋白浓度及炎症细胞比例升高,与模型组比较,龙胆苦苷和地塞米松组BALF中蛋白浓度及炎症细胞比例明显降低。4.模型组的HYP含量明显较多,与模型组比较,地塞米松组和龙胆苦苷组肺组织中羟脯氨酸含量明显降低(P<0.05)。5.RAW264.7、A549、MRC-5细胞生长状态良好,根据绘制的生长曲线,确定实验中的细胞处在对数生长期,所以选取0.8×105个/mL为种板浓度。6.龙胆苦苷体外细胞毒性较小,对RAW264.7、A549、MRC-5细胞的IC50>2mg/ml。7.龙胆苦苷对BLM诱导A549的相关凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达影响;与阴性对照组比较,地塞米松组和龙胆苦苷高剂量组Bax蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测BLM诱导A549细胞的凋亡率实验结果显示:与空白对照组比较,阴性对照组细胞凋亡率高,差异有统计学意义(P<0.01);与阴性对照组比较,龙胆苦苷高剂量、中剂量、低剂量组细胞凋亡减少,差异有统计学意义(P<0.05)。8.龙胆苦苷对TGF-βl诱导A549发生EMT的影响:与空白对照组比较,阴性对照组E-caherin蛋白减少,差异有统计学意义(P<0.05);与阴性对照组比较,地塞米松组和龙胆苦苷高剂量组、中剂量组E-caherin蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,阴性对照组α-SMA蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);与阴性对照组比较,地塞米松组和龙胆苦苷高剂量组、中剂量组、低剂量组蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。9.龙胆苦苷对TGF-β1诱导RAW264.7的NF-κB-P65表达变化的影响;细胞免疫组化实验:与空白对照组比较,阴性对照组NF-κB-P65蛋白增加,差异有统计学意义(P<0.01);与阴性对照组比较,地塞米松组和龙胆苦苷高剂量组、中剂量组、低剂量组蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.01);与地塞米松组比较,龙胆苦苷中剂量组和低剂量组的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测实验:与空白对照组比较,阴性对照组NF-κB-p65蛋白增加,差异有统计学意义(P<0.05);与阴性对照组比较,地塞米松组和龙胆苦苷高剂量组蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.龙胆苦苷能够减轻博来霉素致肺纤维化小鼠肺部病理形态结构变化程度,降低肺内胶原纤维增生,减轻肺纤维化程度。2.龙胆苦苷能够降低小鼠肺系数,使肺组织羟脯氨酸HYP含量减少,抑制肺部炎症反应。3.龙胆苦苷能明显下调博来霉素诱导的肺泡上皮细胞A549的Bax凋亡蛋白,上调凋亡相关Bcl-2,减少肺泡上皮细胞凋亡。4.龙胆苦苷能明显抑制肺泡上皮细胞A549发生EMT。5.龙胆苦苷能明显减少LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的NF-κB-p65蛋白的表达。