心力衰竭是一个严重的临床和公共卫生问题,随着时间的推移,发病率和死亡率显著增加。心衰的特征是交感神经系统和RAAS激活,同时伴有心肌中ROS水平的增加。鉴于氧化应激在心力衰竭中的重要性,清除过量的活性氧来减轻心肌损伤在理论上是可行的,然而,目前大多数的抗氧化治疗措施未能达到预期的效果,这可能与药物在心脏的滞留时间和累积量不足,在其它脏器的非特异性分布较多以及药物的抗氧化能力不足等原因有关。因此,探索新的治疗方法或药物递送方式,以更好的靶向到心肌组织,从而实现减轻心肌损伤的目的。考虑到吸入给药操作简便、依从性好、全身不良反应相对较少等优点,我们构建了一种以抗氧化纳米药物（TPCD NP）为基础的无创雾化吸入递送系统,纳米药物可以通过肺循环到达心肌。另外,为了实现更好的靶向效果,我们通过在TPCD NP的外围修饰上线粒体靶向基团,以显著提高其心肌靶向效率;并通过包载抗炎多肽Ac2-26,进一步提高治疗效果。方法1.基于β-CD的活性氧清除材料的合成与表征将Tempol（Tpl）和4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯（PBAP）结合到β-CD上,合成了一种抗氧化材料TPCD。通过1H NMR和FT-IR对TPCD进行表征。2.溴代十八烷基三苯基膦（STPP）的合成与表征将溴代十八烷与三苯基膦溶于乙腈中,用正己烷和乙醚洗涤,干燥得到STPP。所得材料用1H NMR表征。3.活性氧清除性纳米粒TPCD NP的制备将卵磷脂和DSPE-m PEG2000溶解于乙醇,然后加入去离子水中。将溶解在甲醇中的TPCD加入到上述水相中搅拌。除去机溶剂和多余的水后得到TPCD NP。4.活性氧清除性线粒体靶向纳米粒TTPCD NP的制备将卵磷脂、STPP和DSPE-m PEG2000分散在去离子水中。然后将溶解在有机溶剂中的TPCD加入到上述液体中搅拌。除去有机溶剂和多余的水后得到TTPCD NP。5.活性氧清除性载药纳米粒ATPCD NP和活性氧清除性线粒体靶向载药纳米粒ATTPCD NP的制备将卵磷脂、DSPE-m PEG2000或卵磷脂、DSPE-m PEG2000与STPP溶解于乙醇,然后加入去离子水中。TPCD溶于甲醇,加入溶于DMSO的Ac2-26,将得到的溶液加入到上述水相中搅拌。除去有机溶剂和多余的水,得到ATPCD NP或ATTPCD NP。6.纳米粒的表征分别采用透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）和马尔文激光粒度仪对纳米粒的外貌形态、粒径和Zeta电位进行观察和测定。7.TPCD NP体外活性氧清除能力测定采用H2O2试剂盒和超氧阴离子检测试剂盒检测TPCD NP清除H2O2和超氧阴离子的能力。利用DPPH·来评价TPCD NP清除自由基的能力。8.TPCD NP细胞吞噬实验H9C2细胞与终浓度为50μg/m L Cy5/TPCD NP（Cy5标记的TPCD NP）孵育不同时间后,用共聚焦显微镜（CLSM）检测H9C2细胞对Cy5/TPCD NP的时间依赖性吞噬。同样,与不同剂量Cy5/TPCD NP孵育2 h后,研究细胞对纳米粒的浓度依赖性吞噬。在TTPCD NP吞噬实验中,线粒体用Mito-tracker Green FM染色,CLSM检测H9C2细胞对TPCD NP或TTPCD NP吞噬和线粒体共定位。将A549细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、小鼠巨噬细胞RAW264.7和H9C2细胞培养在12孔板中。H9C2细胞加或不加阿霉素（DOX）,A549细胞、HUVECs和RAW264.7细胞不加DOX。细胞与Cy5/TPCD NP孵育不同时间后,收集细胞通过FACS定量分析细胞对纳米粒的吞噬。同样,与不同剂量Cy5/TPCD NP孵育2 h后,检测细胞吞噬情况。为了比较H9C2细胞对TPCD NP或TTPCD NP的吞噬情况。H9C2细胞加入DOX后。收集细胞进行FACS分析。9.TPCD NP对H9C2细胞内活性氧（ROS）生成的影响先用不同剂量的TPCD NP干预H9C2细胞,再用DOX处理细胞。然后用DCFH-DA染色。采用CLSM检测细胞内ROS水平。在FACS检测细胞内ROS生成的实验中,按照类似的方法,收集细胞采用FACS定量分析细胞内ROS水平。10.丙二醛（MDA）、肌钙蛋白I（c Tn I）、乳酸脱氢酶（LDH）的定量测定先用纳米粒预处理细胞,再用DOX作用于细胞。随后收集细胞培养上清。分别用c Tn I和LDH试剂盒检测c Tn I和LDH水平。同时收集细胞,反复冻融,直到细胞完全裂解。离心后收集上清。用MDA试剂盒检测MDA水平,BCA试剂盒定量总蛋白水平。11.细胞水平初步安全性检测将A549细胞、HUVECs、RAW264.7细胞和H9C2细胞与不同浓度TPCD NP共孵育一定时间。用CCK-8法测定细胞活力。12.TPCD NP经雾化吸入后在体内的分布雄性C57BL/6小鼠暴露在雾化箱中,用Cy7.5/TPCD NP（Cy7.5标记的TPCD NPs）雾化。在不同时间点采集全血及分离心脏等主要脏器。然后采用IVIS小动物活体成像系统进行检测,并计算荧光强度。通过比较气管内给药和雾化吸入给药,采用IVIS进行检测,并计算荧光强度,评估雾化吸入后的剂量,13.TPCD NP经雾化吸入后在肺组织细胞中的分布小鼠雾化吸入Cy5/TPCD NP 24 h后收集肺组织,肺切片分别与Ep CAM、CD31和CD68的抗体孵育。用CLSM检测Cy5/TPCD NP与肺上皮细胞、肺内皮细胞和肺巨噬细胞的共定位情况。另外,雾化吸入Cy5/TPCD NP 60 h后,分离心脏,冰冻切片,用CLSM检测Cy5/TPCD NP在心脏的沉积。Cy5/TPCD NP经雾化吸入24 h后,将肺组织研磨,消化后提取单细胞悬液。然后用CD45R、CD326、CD31、F4/80、CD11b抗体对细胞进行染色,采用FACS定量分析。14.TPCD NP经雾化吸入后在血液白细胞中的分布Cy5/TPCD NP经雾化吸入后12h,采集全血。然后用不同抗体对细胞进行染色,并用FACS进行定量分析。15.TPCD NP对DOX诱导的小鼠心肌损伤疗效评价将10-12周的雄性C57 BL/6小鼠随机分为5组。DOX和DOX+TPCD NP组小鼠均单次腹腔注射DOX（15 mg/kg）。DOX+TPCD NP组小鼠从给予DOX前2 d开始每天雾化吸入TPCD NP（4、10、25 mg/kg）,持续7 d。取心、肝、脾、肺、肾等主要器官。计算器官重量与胫骨长度的比值。采集血样进行血常规和生化分析。为了评价右丙亚胺（DEX）的疗效,在给予DOX前2 h一次性腹腔注射DEX（200mg/kg）。7天后对小鼠实施安乐死。分离心脏和胫骨,计算心脏重量与胫骨长度的比值。为了评价TTPCD NP的疗效,小鼠在给予DOX前2天雾化吸入TPCD NP或TTPCD NP（25 mg/kg）。7天后分离心脏和胫骨,计算心脏重量与胫骨长度的比值。为了评价ATTPCD NP的疗效,小鼠在给予DOX前2天雾化吸入Ac2-26（14.75ug/kg）、TTPCD NP（25 mg/kg）和ATTPCD NP（25 mg/kg）。同样7天后分离心脏和胫骨,计算心脏重量与胫骨长度的比值。16.小鼠心功能检测用异氟醚麻醉小鼠,通过动物超声进行检测、统计。17.血清c Tn I、LDH、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌酸激酶（CK）水平测定试剂盒检测血清c Tn I、LDH、CK-MB和CK的含量。18.氧化应激水平检测心脏冰冻切片与DHE在37℃避光中孵育30 min,荧光显微镜检测。使用Image-pro Plus 6.0软件分析荧光强度。心肌组织经匀浆后离心收集上清。并用ELISA试剂盒测定MDA和H2O2水平。19.病理学分析将心脏固定在4%多聚甲醛中。石蜡包埋切片,用苏木精和伊红（H&E）染色,观察其病理变化。20.TPCD NP的急性毒性评价雾化不同剂量TPCD NP。每天记录体重,7天后采集血液样本进行分析。分离主要脏器称重然后固定。记录肺组织的干重和湿重,计算肺组织的干/湿重比。取肺组织灌洗液,检测TNF-α、IL-1β水平。结果1.TPCD NP的制备与表征通过将Tpl和PBAP结合到β-CD上,合成了一种抗氧化材料TPCD。根据1H NMR谱上的质子信号,TPCD的每个β-CD分子上约有2个Tpl和5个PBAP。采用改进的纳米沉淀法/自组装法制备TPCD NP。TEM和SEM观察发现TPCD NP呈球形。平均粒径为101 nm,zeta电位为-29.4±1.7 m V。TPCD NP能有效清除H2O2和超氧阴离子。此外,TPCD NP对DPPH自由基呈时间依赖性和剂量依赖性清除。2.TPCD NP的体外生物活性研究H9C2细胞、A549细胞、HUVECs和RAW264.7细胞能有效吞噬Cy5/TPCD NP,呈时间和剂量依赖性。此外,结果显示,DOX作用于H9C2细胞对Cy5/TPCD NP的吞噬效率显著高于未加DOX作用的细胞。TPCD NP预处理可剂量依赖性地降低DOX作用后H9C2细胞中ROS的水平,抑制MDA的生成,以及降低c Tn I和LDH的释放。3.雾化吸入后TPCD NP的心肌靶向能力及作用机制研究吸入的Cy7.5/TPCD NP逐渐被吸收并转运到心脏。免疫荧光分析显示,吸入后Cy5/TPCD NP与肺Ep CAM+上皮细胞、CD31+内皮细胞和CD68+巨噬细胞有共定位。FACS检测表明Cy5/TPCD NP的吸收和转运主要由肺上皮细胞和肺内皮细胞介导。通过比较气管内给药和雾化吸入给药肺部荧光强度,约4%的TPCD NP在肺内沉积。4.雾化吸入TPCD NP靶向治疗DOX诱导的心力衰竭TPCD NP可显著增加DOX引起的心脏重量和HW/TL的降低,减轻心功能障碍。同时降低了MDA、H2O2等氧化应激相关标志物以及c Tn I、CK-MB等心脏损伤指标的水平。5.TPCD NP和DEX对DOX诱导的小鼠心力衰竭的疗效TPCD NP和DEX均可增加DOX导致的LVEF和LVFS的降低,改善心脏功能。显著增加DOX导致HW/TL比值降低。降低心肌MDA、H2O2水平及血清c Tn I、CK水平。6.靶向纳米粒的制备表征及体外生物活性研究TTPCD NP呈球形,平均粒径为104 nm,zeta电位为-14.3 m V。Cy5/TTPCD NP能被H9C2细胞有效吞噬。TTPCD NP的靶向性较TPCD NP提高。与这一发现相一致的是,TTPCD NP比TPCD NP更显著的减轻DOX诱导的H9C2细胞氧化应激损伤。7.TTPCD NP的心肌靶向及对心衰模型疗效评价在心脏部位,Cy7.5/TTPCD NP具有相对较强的荧光。与TPCD NP相比,TTPCD NP更有效地抑制了HW/TL比值的降低。同样,TTPCD NP显著减轻心功能障碍,降低了心肌MDA和H2O2含量及血清c Tn I和CK水平。8.靶向载药纳米粒的制备、表征及对心衰小鼠模型的的疗效评价采用改进的纳米沉淀法/自组装法将Ac2-26多肽包载到TPCD NP或TTPCD NP中,这种含有Ac2-26的TPCD NP或TTPCD NP平均粒径分别为103.9 nm和109.7 nm。zeta电位分别为-32.9±1.2 m V和13.3±0.2 m V。Ac2-26的载药量为0.59μg/mg。与Ac2-26相比,ATPCD NP和ATTPCD NP更有效的减轻DOX诱导的H9C2细胞的氧化应激损伤。动物实验结果表明,ATPCD NP和ATTPCD NP可更有效的抑制DOX作用后心脏重量的下降、减轻心肌损伤,改善心功能,以ATTPCD NP的效果最佳。9.TPCD NP体内安全性评价经与不同剂量的TPCD NP孵育后,H9C2细胞、A549细胞、HUVECs和RAW264.7巨噬细胞均有较高的细胞活力。吸入高剂量的TPCD NP后,小鼠的体重、脏器指数和肺干/湿重比均无显著变化。肺泡灌洗液中炎性细胞因子TNF-α、IL-β以及血常规和肝肾功没有出现异常改变,HE切片显示气管、肺和其他主要器官未见明显损伤。结论1.本研究通过将Tpl和PBAP结合到β-CD上,成功合成了抗氧化材料TPCD并制备了其纳米粒。体外实验表明,TPCD NP能被H9C2细胞吞噬,通过清除过量活性氧,减轻心肌细胞的氧化应激损伤。2.雾化吸入的TPCD NP在肺部的吸收和转运主要由肺泡上皮细胞和内皮细胞介导,进入肺毛细血管的TPCD NP将进一步经过肺循环和体循环到达心肌。3.雾化吸入的TPCD NP可显著抑制DOX诱导的小鼠心肌功能失调,其疗效明显优于临床使用的药物右丙亚胺。4.通过线粒体靶向基团的修饰,TTPCD NP的心肌靶向能力、细胞吞噬效率较TPCD NP显著增强,治疗效果更加显著。TTPCD NP对DOX诱导的心功能障碍有更显著的改善作用。ATTPCD NP对小鼠的心功能保护作用较TTPCD NP进一步增强。5.初步急毒实验结果显示,雾化吸入高剂量的TPCD NP对小鼠无明显毒性作用。