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为了保证DNA复制精准地完成,所有真核生物都有一套保守的机制实时监控DNA复制叉的整个运行过程,这个机制就是DNA复制检验点(DNA replication checkpoint),又称为S期检验点(S-phase checkpoint)。当细胞遭遇复制压力或DNA损伤时,S期检验点通路会被激活,继而通过稳定复制叉、延长S期进程、启动DNA修复或细胞凋亡等一系列响应来维护基因组的稳定性。S期检验点机制的失效,往往导致基因组不稳定、细胞周期异常及细胞癌变甚至死亡等。尽管多年来的研究已揭示了 S期检验点的主干通路(Mecl/ATR-Rad53/Chk2),但是仍有许多未知调控组分有待发掘。并且,迄今仍缺乏对这个通路的全局性认识。本研究采用高通量遗传互作图谱技术(epistatic miniarray profile,E-MAP),对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S期检验点进行了系统生物学研究。该技术主要通过定量测量突变体的菌落大小来计算遗传互作。E-MAP有传统遗传研究方法无法比拟的优势:第一,采用机器人操作,使双突变体的获得实现自动化和高通量化;第二,引入图像分析技术测量菌落大小,实现了定量分析。本研究首先主要选取DNA复制、DNA修复、检验点等相关基因构建了 121个单基因(问询基因)敲除突变体。1,536个文库基因则涵盖了细胞周期、DNA复制、染色体组装与修饰等相关的主要基因。利用高通量双敲除突变体筛选平台将两种不同交配型菌株杂交,通过一系列筛选,最终获得了 121×1,536个以阵列排布的双敲除突变体。根据突变体菌落大小,通过计算S-score和显著性分析,得到约140,000对基因相互作用(genetic interaction,GI),含正相互作用56,891对,负相互作用91,251对,其中43,392对遗传互作为首次报道。通过比较,本E-MAP数据与已有的E-MAP数据及BioGiid数据库数据一致率分别高达81.15%和75.13%。据此,本研究绘制了首个较为系统的酵母细胞S期检验点网络。与之前实验不同,本研究还引入了羟基脲(HU)和甲磺酸甲酯(MMS)两种药物来造成DNA复制胁迫或DNA损伤。结果显示,加入药物后,分别有30,097和26,966对GI类型发生了显著变化,占该条件下所有GI数的53.40%和58.45%,从而获得了酵母应对复制胁迫和DNA损伤时的动态调控网络。本研究以S期检验点重要信号感应因子9-1-1复合体(酿酒酵母(Sfaccharomyces cerevisiees Ddcl-Rad17-Mec3,与人Rad9-Radl-Husl同源)为中心,对其动态响应网络进行了深入的数据挖掘。由于9-1-1作为一个整体参与上游激酶Mecl/ATR的激活,本研究遴选出与三者都存在显著相互作用的新基因,这些基因很可能就是挖掘到的S期检验点的新组分。这些新组分中,本研究选择染色质组装复合体(CAF-1)大亚基CAC1基因,对它在S期检验点中可能的功能进行了深入分析。梯度稀释实验显示,在含HU或MMS药物平板上,相对于cac1Δ和9-1-1复合体各亚基的单突变体,CAC1与9-1-1任何一个亚基的双敲除突变体均表现出很高的药物敏感性。这一结果进一步证明了高通量数据的可信度。同时,过表达脱氧核糖核酸还原酶(RNR)大亚基RNR1或RNR3,均能回补该表型。在MMS处理的S期细胞中,相较于单突变体,CAC1与9-1-1亚基组成的双敲除突变体中Rfal的募集(foci)量明显减少;Rad53激酶磷酸化水平显著降低。这些结果说明Mecl-Rad53检验点通路的激活受阻。另外,在tel1Δddc1Δ突变体基础上进一步敲除C4C1基因会导致细胞不能响应DNA损伤,不能阻滞细胞周期行进。本研究还通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验发现CAF-1和Mec1/Ddc2激酶有物理互作,并且该互作在有HU或MMS时会增强。同时,本研究用体外激酶实验发现CAF-1是Mec1的底物。所有这些结果揭示了 CAF-1复合体在核小体组装以外的一个新的重要生物学功能,即在DNA复制检验点感应激酶Mec1的上游,构成一条与9-1-1平行的Mec1早期激活途径。同时,本研究还发现组蛋白转录基因SPT21的缺失也会造成Rad53激活缺陷。综上所述,本研究对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的S期检验点进行了系统生物学研究,绘制了高质量的“静态”和复制胁迫下的“动态”遗传互作图谱,极大地扩展和丰富了对酵母维持基因组稳定性网络的认识。通过对高通量数据的深入挖掘,发现了参与DNA复制检验点调控的重要新组分。通过对组蛋白伴侣CAF-1复合物功能的重点分析,提出了与9-1-1平行的新激活模型,首次揭示组蛋白装配与DNA复制检验点激活通路之间的关系。这项研究为S期检验点研究提供了崭新的全局性视角,同时也为今后进一步完善S期检验点调控网络提供了重要线索和启示。