背景背景:作为老年性疾病,脊柱退变性疾病(SDD)与骨质疏松症(OP)常常同时伴发,两者相互影响。骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性的骨代谢疾病,以骨量减少和骨小梁微观结构发生退变为特征的系统性疾病。骨质疏松可涉及全身骨骼,但在脊柱中往往出现的更早,临床症状更为明显。常可导致椎体形态、脊柱生理曲度和力学性质的改变,从而加剧脊柱退变发生的进程。这两种疾病之间相互影响的关系越来越受到关注。因此如何从两者整体防治角度去寻找改善骨质疏松的有效药物,明确其作用机理仍是目前临床必需思考和解决的基础性问题。第一部分淫羊藿苷与牛血清白蛋白的偶联、鉴定及提纯目的目的:构建、提纯淫羊藿苷(ICA)与牛血清白蛋白(BSA)偶合物,并进而验证偶合物的不透膜性。方法:方法:利用淫羊藿苷与BSA之间的氢键作用和范德华力促使两者结合,然后运用紫外-可见吸收光谱分别扫描淫羊藿苷、BSA及淫羊藿苷与BSA等摩尔混合物以验证淫羊藿苷和BSA是否形成了偶合物。并运用sephdaex G-25层析柱技术将其与淫羊藿苷分离。最后借助液相质谱测定成骨细胞内ICA浓度。结果:通过紫外-可见吸收光谱检测我们发现BSA的紫外光吸收峰值约在285nm处,ICA的峰值在291nm处,而ICA—BSA偶合物的紫外吸收峰值约在300nm处,而且ICA—BSA混合液的吸光度曲线波形并非是单纯的ICA波形及BSA波形相加,其吸光度峰值也发生了改变。在后续进行的层析结果中,在各个个紫外光波段下第一管到第四管都逐渐增高,第四组为峰值;而第四管到第十二管就逐渐降低。且通过液相质谱证明了第四管偶合物的不透膜性。结论:结论:上述实验结果说明ICA、BSA分子间发生了能量迁移,即ICA与BSA发生了反应,形成了偶合物。通过层析技术成功的将ICA-BSA偶合物进行了分离,偶合物主要集中在第四管中,具有不透膜性,可以在后续的实验中使用。第二部分淫羊藿苷非核效应在成骨细胞增殖中的作用目的:目的:检测淫羊藿苷(ICA)非核效应在成骨细胞增殖中的作用,并通过研究雌激素受体抑制剂(ICI182780)对ICA增殖作用的影响,探讨ICA促成骨细胞增殖中非核效应(non-nuclear effects)与雌激素受体的关系。方法:方法:酶消化法从新生SD大鼠颅盖骨中分离、培养成骨细胞,并进行染色与鉴定。将ICA与BSA偶联,采用Sephadex G-25凝胶层析技术对偶联产物进行脱盐提纯。将成骨细胞分为A组(ICA干预组)、B组(ICA-BSA干预组)、C组(ICI182780+Icariin–BSA干预组),实验用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)及细胞流式检测各组药物对成骨细胞快速增殖的影响。结果:结果:试验成功分离和获得的大量单一多角形细胞,经碱性磷酸酶和钙化结节染色,证实获得的细胞为成骨细胞。实验成功将ICA与BSA进行偶联、脱盐提纯及鉴定。MTT及细胞流式检测结果显示ICA-BSA组能快速促进成骨细胞的增殖,与其他2组相比具有明显统计学差异(P<0.05)。结论:结论:本研究结果显示不能通过细胞膜的ICA-BSA与ICA一样能促进成骨细胞增殖,说明ICA在促成骨细胞增殖中非核效应的存在。而这一效应在成骨细胞中能够被雌激素受体的抑制剂所阻断,可以由此推测ICA的非核效应是由膜雌激素受体介导的。第三部分成骨细胞中淫羊藿苷非核效应的信号通路研究目的:目的:通过检测成骨细胞在淫羊藿苷作用后细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化、[Ca2+]i浓度的变化,探讨在成骨细胞中,淫羊藿苷非核效应的信号传导途径。方法:方法:采用Western Blot方法检测成骨细胞分别在ICA和ICA-BSA干预后,胞浆中ERK1/2的磷酸化程度,来反映MAPK通路的激活。利用光吸收指示剂法,在荧光共聚焦显微镜下动态观测加入ICA和ICA-BSA后,成骨细胞内钙离子浓度的变化。同时检测ICI 182780、PD 98059对这些信号分子及细胞内钙离子浓度改变的影响。结果:结果:在淫羊藿苷对MAPK活化的研究中,ICA以及ICA-BSA均能快速促进ERK1/2的磷酸化及胞内钙离子浓度的增加。当对成骨细胞给以ICI 182780和PD98059预处理后,ICA和ICA-BSA对ERK1/2的活化及升高胞内钙离子浓度作用均被抑制。结论:结论:能够透膜进入细胞内的ICA和不能透膜的ICA-BSA都能够引发成骨细胞内ERK的快速磷酸化,以及细胞内钙的增加,并且这种作用在成骨细胞能够被ER的拮抗剂ICI 182780和和MEK1的特异性抑制剂PD98059所抑制,可以推测淫羊藿苷的这种非核效应是由雌激素受体介导的,且MAPK信号通路在此过程中发挥着重要作用。